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Item Assisted selection using molecular markers linked to rust resistance SH3 gene in Coffea arabica(Crop Breeding and Applied Biotechnology, 2023-10-25) Silva, Angelita Garbossi; Ariyoshi, Caroline; Shigueoka, Luciana Harumi; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Sera, Gustavo HiroshiThe aim of this work was to validate markers linked to the SH3 gene of coffee leaf rust (CLR) resistance and use them in assisted selection. Initially, we validated the markers in genotypes already known to carry SH3. Next, we performed phenotype and genotype evaluation for resistance to CLR in coffee plants growing under field conditions. We used Arabica coffee progenies derived from BA-10, which carries the SH3 gene due to introgression of C. liberica. Three SCAR markers (SP-M16-SH3, BA-48-21O-f, and BA-124-12K-f) and one SSR marker (Sat244) linked to SH3 gene were used to amplify the coffee plants’ DNA. Our assessments of markers validation in resistant genotypes, SP-M16-SH3 and BA-124-12K-f, were efficient to identify the SH3 gene. These two markers were used to evaluate the progenies derived from BA-10 and were significantly linked to the phenotype evaluations. The SP-M16-SH3 marker was more efficient, with the advantage of being codominant.Item A new set of quantitative trait loci linked to lipid content in Coffea arabica(Crop Breeding and Applied Biotechnology, 2024-04-10) Muniz, Herison Victor Lima; Ariyoshi, Caroline; Ferreira, Rafaelle Vecchia; Felicio, Mariane Silva; Pereira, Luiz Filipe ProtasioLipids are compounds that play an important role in coffee bean development, contributing to beverage quality. Genome-wide association studies (GWAS) were conducted to pinpoint quantitative trait nucleotides (QTNs) linked to lipid metabolism in Coffea arabica. Genotyping by sequencing (GBS) and phenotyping data from 104 wild C. arabica accessions, Mundo Novo cultivar, and C. arabica var. Typica were utilized. GBS data were aligned to C. arabica Et039 reference genome, and both single-locus and multi-locus GWAS methods were employed. Methods were adjusted for kinship matrix, population structure, and principal component analysis. Of the 19 QTNs identified, 5 showed consistency across different population structure adjustments. The multi-locus methods mrMLM and FarmCPU proved more effective in identifying QTNs associated with lipid content. Four QTNs were situated near seven genes potentially involved in lipid metabolism. Higher frequencies of identified QTNs in accessions with elevated lipid content suggest their utility as markers for coffee plant breeding.Item Galactinol synthase transcriptional profile in two genotypes of Coffea canephora with contrasting tolerance to drought(Sociedade Brasileira de Genética, 2015) Santos, Tiago Benedito Dos; Lima, Rogério Barbosa de; Nagashima, Getúlio Takashi; Petkowicz, Carmen Lucia de Oliveira; Carpentieri-Pípolo, Valéria; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Domingues, Douglas Silva; Vieira, Luiz Gonzaga EstevesIncreased synthesis of galactinol and raffinose family oligosaccharides (RFOs) has been reported in vegetative tissues in response to a range of abiotic stresses. In this work, we evaluated the transcriptional profile of a Coffea canephora galactinol synthase gene (CcGolS1) in two clones that differed in tolerance to water deficit in order to assess the contribution of this gene to drought tolerance. The expression of CcGolS1 in leaves was differentially regulated by water deficit, depending on the intensity of stress and the genotype. In clone 109A (drought-susceptible), the abundance of CcGolS1 transcripts decreased upon exposure to drought, reaching minimum values during recovery from severe water deficit and stress. In contrast, CcGolS1 gene expression in clone 14 (drought-tolerant) was stimulated by water deficit. Changes in galactinol and RFO content did not correlate with variation in the steady-state transcript level. However, the magnitude of increase in RFO accumulation was higher in the tolerant cultivar, mainly under severe water deficit. The finding that the drought-tolerant coffee clone showed enhanced accumulation of CcGolS1 transcripts and RFOs under water deficit suggests the possibility of using this gene to improve drought tolerance in this important crop.Item Influence of Silver Nitrate on Somatic Embryogenesis Induction in Arabica Coffee (Coffea arabica L.)(Instituto de Tecnologia do Paraná - Tecpar, 2019) Rojas-Lorz, Laura; Arrieta-Espinoza, Griselda; Valdez-Melara, Marta; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Gatica-Arias, AndrésThe influence of silver nitrate (AgNO3), benzyladenine (BAP), and indole-3-acetic acid (IAA) on low frequency somatic embryogenesis (LFSE) induction in Caturra and Catuaí arabica coffee was evaluated. For the Caturra cultivar, the production of somatic embryos was significantly increased by adding AgNO3 to the semisolid culture medium. The highest average number of somatic embryos for this cultivar was obtained using 6.6 μM BAP, 2.85 μM IAA, and 40 μM AgNO3. In contrast, for the Catuaí cultivar, the highest average number of somatic embryos was obtained using semisolid medium supplemented with 8.8 μM BAP, and 2.85 μM IAA. Using these protocols, somatic embryos were directly induced using leaf sections of in vitro plants of both coffee cultivars within 8 weeks. The somatic embryos developed into rooted plants with a 100% survival rate upon transfer to the greenhouse.Item Caracterização de promotores de Coffea spp. via transformação genética em planta modelo(Embrapa Café, 2019-10) Girotto, Larissa; Ivamoto-Suzuki, Suzana Tiemi; Oliveira, Fernanda Freitas de; Aryoshi, Caroline; Santos, Tiago Benedito dos; Pereira, Luiz Filipe ProtasioAs mudanças climáticas globais têm causados danos a produtividade agrícola cafeeira com impactos econômicos e sociais, e apresentam o potencial de reduzir áreas disponíveis para o plantio de cafeeiros. Diante deste cenário foi investigado o potencial do promotor da galactinol sintase (GolS) do gênero Coffea, que catalisa a primeira etapa da via de síntese de oligossacarídeos da família da Rafinose, cujo acúmulo ocorre principalmente em resposta a estresses abióticos. Entender a estrutura e composição de sequências gênicas promotoras de cafeeiros é de fundamental importância para compreender melhor os mecanismos genéticos e os processos de regulação da expressão gênica induzidos em períodos de estresse hídrico e salino. Neste estudo identificamos 14 promotores GolS presentes nos genomas de Coffea arabica, C. canephora e C. eugenioides. Dentro das regiões promotoras desses genes, foram observados 12 cis-elementos relacionados a regulação de genes em resposta a condições adversas, dentre eles: ARE, ABRE, MYB e STRE. Após a caracterização in silico dos 14 promotores, o promotor da isoforma de GolS3 (CcGolS3) de Coffea canephora (Cc) foi clonada com o objetivo de verificar o seu comportamento frente a estresses abióticos. Plasmídeos contendo a construção pCcGolS3::GUS (gene repórter da β-glucuronidase) foram inseridos em Arabidopsis thaliana via transformação genética com Agrobacterium tumefaciens. A coloração histoquímica do gene repórter GUS foi verificada em todos os tecidos de A. thaliana transformadas. Para analisar o comportamento deste promotor, as plantas de A. thaliana foram submetidas a estresses hídrico e salino in vitro (0h, 12h, 24h e 48h), os seus respectivos RNAs foram extraídos e a síntese de cDNA foi realizada para a quantificação da atividade transcricional do gene repórter GUS via RT-qPCR. Os nossos resultados indicaram que o promotor de CcGolS3 pode ser caracterizado como do tipo estresse-induzido, visto que o perfil transcricional do gene GUS diretamente proporcional ao tempo de duração dos estresses. O promotor do gene CcGolS3 apresenta um grande potencial para ser utilizado em projetos futuros de melhoramento genético de cafeeiros e obtenção de plantas mais tolerantes a estresses abióticos.Item Transcriptoma de C. arabica L. revela diferenças na expressão de genes envolvidos na biossíntese da rafinose(Embrapa Café, 2019-10) Ivamoto-Suzuki, Suzana Tiemi; Reis Junior, Osvaldo; Domingues, Douglas Silva; Santos, Tiago Benedito dos; Oliveira, Fernanda Freitas de; Girotto, Larissa; Ariyoshi, Caroline; Pot, David; Leroy, Thierry; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Carazzolle, Marcelo Falsarella; Pereira, Gonçalo Amarante Guimarães; Pereira, Luiz Filipe ProtasioCoffea arabica L. é uma cultura importante em vários países em desenvolvimento. Apesar de sua importância econômica, os dados do transcriptoma mínimo estão disponíveis para tecidos de frutas, especialmente o perisperma, onde vários compostos relacionados à qualidade do café são produzidos. Para compreender os aspectos moleculares relacionados ao desenvolvimento de frutos e grãos de café, relatamos uma análise transcriptoma em larga escala de folhas, flores e frutos. O sequenciamento da Illumina (RNA-seq) resultou em 41.881.572 sequências trimadas com alta qualidade. A montagem de novo gerou 65.364 unigenes com um comprimento médio de 1.264 pb. Um total de 24.548 unigenes foram anotados como genes codificadores de proteínas, dos quais 12.560 sequências eram completas para esta codificação (full lenghts). No processo de anotação, identificamos nove genes candidatos relacionados à biossíntese de oligossacarídeos da família da rafinose (RFOs). Estes açúcares conferem osmoproteção e são acumulados durante o desenvolvimento inicial dos frutos. Quatro genes dessa via tiveram o seu padrão transcricional validado pela reação em cadeia da polimerase via transcrição reversa quantitativa em tempo real (RT-qPCR). Este atlas transcriptômico de C. arabica fornece um importante passo para a identificação de genes candidatos relacionados a diversas vias metabólicas do café, especialmente aquelas relacionadas à composição química dos frutos e a qualidade da bebida. Nossos resultados são o ponto de partida para aumentar o conhecimento sobre as proteínas do café que são produzidas durante os estádios de floração e desenvolvimento inicial dos frutos.Item Edição gênica de cafeeiro via CRISPR-Cas9: clonagem de sgRNAS de genes da biossíntese da cafeína(Embrapa Café, 2019-10) Oliveira, Fernanda Freitas de; Aryioshi, Caroline; Girotto, Larissa; Santos, Tiago Benedito dos; Tomaz, Juarez Pires; Pereira, Luiz Filipe ProtasioO café descafeinado apresenta uma demanda crescente do mercado consumidor, sendo portanto uma alternativa para produtores e indústria. Uma das alternativas de produção de cafés descafeinados é o silenciamento gênico via CRISPR-Cas9. O CRISPR-Cas9 é uma das ferramentas mais potentes e precisas de edição gênica, que consiste na utilização de um RNA guia (sgRNA) e de uma proteína Cas9 que reconhece regiões homólogas ao sgRNA e cliva o DNA, possibilitando o silenciamento do gene alvo. Visando iniciar trabalhos para produção de plantas de café descafeinado, neste trabalho apresentamos a estratégia de clonagem e produção de vetores CRISPR-Cas9 com sgRNAs para os genes da biossíntese da cafeína CaMXMT e CaDXMT Os sgRNAS foram desenhados na plataforma CRISPRdirect ® utilizando o C. canephora como genoma de referência. Dos 276 sgRNAs de MXMT e 317 de DXMT, foram selecionados os com menor número de off-targets e posicionados próximos a região terminal do genes, sendo três sgRNAs de cada gene: sgMXMT 1 , sgMXMT 2 , sgMXMT 3 , sgDXMT 1 , sgDXMT 2 , sgDXMT 3 . Para validar se os sgRNAs possuíam homologia com o genoma de C. arabica, foi realizado blast com o software BioEdit ® . Foi possível analisar através do alinhamento que os três sgRNAs de CaMXMT alinharam-se nos cromossomos “I” dos subgenoma de C. canephora e que sgMXMT 1 e sgMXMT 3 alinharam-se também no cromossomo “I” do subgenoma de C. eugenioides. Já os sgRNAs desenhados para CaDXMT, todos se alinharam ao cromossomo “A” no subgenoma de C. canephora. Apesar de não haver alinhamento no subgenoma de C. eugenioides, houve alinhamento no Scaffold 405, que contém a região gênica de DXMT de C. eugenioides, não sendo então um off-target. Os sgRNAs sgMXMT 1 e sgDXMT 1 foram ligados nos vetores pHAtc e pBAtc através de eletroporação. Foram positivadas por PCR 4 colônias para a ligação pHAtc/sgMXMT 1 , 3 para pHAtc/sgDXMT 1 e 2 para pBAtc/sgMXMT 1 . As colônias positivas na PCR foram também validadas por sequenciamento e detectou-se a inserção correta dos sgRNAs na posição esperada.Item Production of herbicide-resistant coffee plants (Coffea canephora P.) via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation(Instituto de Tecnologia do Paraná - Tecpar, 2006-01) Ribas, Alessandra Ferreira; Kobayashi, Adilson Kenji; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga EstevesTransgenic plants of Coffea canephora P. resistant to the herbicide ammonium glufosinate were regenerated from leaf explants after co-culture with Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 harboring pCambia3301, a plasmid that contains the bar and the uidA genes both under control of 35S promoter. Direct somatic embryogenesis was induced on basal medium contained 1⁄4 strength macro salts and half strength micro salts of MS medium, organic constituents of B 5 medium and 30 g.L -1 sucrose supplemented with 5 μ M N 6 – (2-isopentenyl)-adenine (2-iP). Ten μ M ammonium glufosinate was used for putative transgenic somatic embryos selection. Presence and integration of the bar gene were confirmed by PCR and Southern blot analysis. Selected transgenic coffee plants sprayed with up to 1600 mg.L -1 of Finale , a herbicide containing glufosinate as the active ingredient, retained their pigmentation and continued to grow normally during ex vitro acclimation.Item Composição química de cafés árabica de cultivares tradicionais e modernas(Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Embrapa, 2013-11) Kitzberger, Cíntia Sorane Good; Scholz, Maria Brígida dos Santos; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Benassi, Marta de ToledoO objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da diversidade genética sobre a composição química de cultivares modernas e tradicionais de café arábica brasileiro. Cultivares tradicionais (Bourbon, Catuaí e Icatu) e modernas (Iapar 59, IPR 98, IPR 99 e IPR 103) foram cultivadas nas mesmas condições edafoclimáticas e submetidas a tratamentos pós‐colheita padronizados. Determinaram-se os teores de sacarose, açúcares redutores, ácidos orgânicos (quínico, málico e cítrico), compostos fenólicos totais, ácido 5‐cafeoilquínico, compostos nitrogenados (proteína, trigonelina e cafeína), lipídeos totais, cafestol e caveol. A diversidade genética confere variabilidade à composição do café e permite a discriminação entre cultivares tradicionais e modernas. As cultivares modernas apresentam maior teor de ácidos málico e 5‐cafeoilquínico, lipídeos totais, caveol e trigonelina. Os parâmetros caveol e a relação caveol/ cafestol são propostos como discriminadores entre cultivares modernas e tradicionais, uma vez que a introgressão de genes de Coffea canephora aumenta os teores de caveol e os valores da relação caveol/cafestol.Item Caracterização nutricional de acessos provenientes da Etiópia de café arábica(Editora UFLA, 2015-01) Santos, Tiago Benedito dos; Meda, Anderson Rotter; Sitta, Renata Barrufaldi; Vespero, Eduardo Brandalize; Pavan, Marcos Antonio; Charmetant, Pierre; Carpentieri- Pípolo, Valéria; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Domingues, Douglas SilvaDevido à necessidade cada vez maior de cultivares que apresentem boa produtividade com impactos menores ao meio ambiente, a introgressão de características relacionadas ao uso eficiente de nutrientes minerais é uma estratégia relevante para o melhoramento genético do café. Nesse sentido, a caracterização de acessos provenientes do centro de origem da espécie é um importante subsídio para os programas de melhoramento visando à seleção de materiais de interesse para produção de novas cultivares. Objetivou-se,no presente trabalho, caracterizar a concentração de nove nutrientes minerais em 12 acessos de Coffea arabica L., provenientes da Etiópia, em casa de vegetação, visando identificar genótipos com acumulação diferencial de nutrientes minerais em folhas, caule e raízes. Com base nos parâmetros estabelecidos, o acesso E237/CAF032 apresentou acúmulo diferencial para P, em folhas e E565/CAF009, E386/CAF131 e E332/CAF023 apresentaram concentração diferencial de N, Zn e Mn em raízes, respectivamente. O presente trabalho selecionou um acesso com potencial eficiência para uso de P e outro com potencial eficiência para o uso de N, o que pode contribuir em futuros estudos de seleção de materiais que possam ser utilizados na introgressão de características relacionadas à eficiência nutricional.