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Item Galactinol synthase transcriptional profile in two genotypes of Coffea canephora with contrasting tolerance to drought(Sociedade Brasileira de Genética, 2015) Santos, Tiago Benedito Dos; Lima, Rogério Barbosa de; Nagashima, Getúlio Takashi; Petkowicz, Carmen Lucia de Oliveira; Carpentieri-Pípolo, Valéria; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Domingues, Douglas Silva; Vieira, Luiz Gonzaga EstevesIncreased synthesis of galactinol and raffinose family oligosaccharides (RFOs) has been reported in vegetative tissues in response to a range of abiotic stresses. In this work, we evaluated the transcriptional profile of a Coffea canephora galactinol synthase gene (CcGolS1) in two clones that differed in tolerance to water deficit in order to assess the contribution of this gene to drought tolerance. The expression of CcGolS1 in leaves was differentially regulated by water deficit, depending on the intensity of stress and the genotype. In clone 109A (drought-susceptible), the abundance of CcGolS1 transcripts decreased upon exposure to drought, reaching minimum values during recovery from severe water deficit and stress. In contrast, CcGolS1 gene expression in clone 14 (drought-tolerant) was stimulated by water deficit. Changes in galactinol and RFO content did not correlate with variation in the steady-state transcript level. However, the magnitude of increase in RFO accumulation was higher in the tolerant cultivar, mainly under severe water deficit. The finding that the drought-tolerant coffee clone showed enhanced accumulation of CcGolS1 transcripts and RFOs under water deficit suggests the possibility of using this gene to improve drought tolerance in this important crop.Item Transcriptoma de C. arabica L. revela diferenças na expressão de genes envolvidos na biossíntese da rafinose(Embrapa Café, 2019-10) Ivamoto-Suzuki, Suzana Tiemi; Reis Junior, Osvaldo; Domingues, Douglas Silva; Santos, Tiago Benedito dos; Oliveira, Fernanda Freitas de; Girotto, Larissa; Ariyoshi, Caroline; Pot, David; Leroy, Thierry; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Carazzolle, Marcelo Falsarella; Pereira, Gonçalo Amarante Guimarães; Pereira, Luiz Filipe ProtasioCoffea arabica L. é uma cultura importante em vários países em desenvolvimento. Apesar de sua importância econômica, os dados do transcriptoma mínimo estão disponíveis para tecidos de frutas, especialmente o perisperma, onde vários compostos relacionados à qualidade do café são produzidos. Para compreender os aspectos moleculares relacionados ao desenvolvimento de frutos e grãos de café, relatamos uma análise transcriptoma em larga escala de folhas, flores e frutos. O sequenciamento da Illumina (RNA-seq) resultou em 41.881.572 sequências trimadas com alta qualidade. A montagem de novo gerou 65.364 unigenes com um comprimento médio de 1.264 pb. Um total de 24.548 unigenes foram anotados como genes codificadores de proteínas, dos quais 12.560 sequências eram completas para esta codificação (full lenghts). No processo de anotação, identificamos nove genes candidatos relacionados à biossíntese de oligossacarídeos da família da rafinose (RFOs). Estes açúcares conferem osmoproteção e são acumulados durante o desenvolvimento inicial dos frutos. Quatro genes dessa via tiveram o seu padrão transcricional validado pela reação em cadeia da polimerase via transcrição reversa quantitativa em tempo real (RT-qPCR). Este atlas transcriptômico de C. arabica fornece um importante passo para a identificação de genes candidatos relacionados a diversas vias metabólicas do café, especialmente aquelas relacionadas à composição química dos frutos e a qualidade da bebida. Nossos resultados são o ponto de partida para aumentar o conhecimento sobre as proteínas do café que são produzidas durante os estádios de floração e desenvolvimento inicial dos frutos.Item Production of herbicide-resistant coffee plants (Coffea canephora P.) via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation(Instituto de Tecnologia do Paraná - Tecpar, 2006-01) Ribas, Alessandra Ferreira; Kobayashi, Adilson Kenji; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga EstevesTransgenic plants of Coffea canephora P. resistant to the herbicide ammonium glufosinate were regenerated from leaf explants after co-culture with Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 harboring pCambia3301, a plasmid that contains the bar and the uidA genes both under control of 35S promoter. Direct somatic embryogenesis was induced on basal medium contained 1⁄4 strength macro salts and half strength micro salts of MS medium, organic constituents of B 5 medium and 30 g.L -1 sucrose supplemented with 5 μ M N 6 – (2-isopentenyl)-adenine (2-iP). Ten μ M ammonium glufosinate was used for putative transgenic somatic embryos selection. Presence and integration of the bar gene were confirmed by PCR and Southern blot analysis. Selected transgenic coffee plants sprayed with up to 1600 mg.L -1 of Finale , a herbicide containing glufosinate as the active ingredient, retained their pigmentation and continued to grow normally during ex vitro acclimation.Item Diversidade nucleotídica de genes envolvidos na biossíntese de ácidos clorogênicos de cafeeiros(Editora UFLA, 2013-04) Ivamoto, Suzana Tiemi; Pot, David; Lannes, Sergio Dias; Domingues, Douglas Silva; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Pereira, Luiz Filipe ProtasioOs ácidos clorogênicos (CGAs) são compostos químicos importantes de Coffea spp. para a qualidade da bebida, pois eles interferem na adstringência e podem alterar o aroma e sabor da bebida. Aproximadamente 310.000 ESTs de Coffea estão disponíveis e possibilitam o acesso à variabilidade nucleotídica da planta e o desenvolvimento de marcadores moleculares ligados à qualidade da bebida para as principais enzimas da via de biossíntese dos CGAs: PAL, C4H, 4CL, CQT e C3’H. Neste trabalho foram detectados polimorfismos dos tipos SNP, INDEL ou SSR dentro das sequências nucleotídidicas disponíveis no Protejo Genoma Café e no NCBI. As sequências de ESTs de CGAs foram clusterizadas pelo programa Codon Code Aligner, assim como a detecção de polimorfismos e validação dos mesmos (qualidade de cromatograma). Foram identificadas seis isoformas para PAL, uma para C4H, seis para 4CL, duas para CQT e duas para C3’H. Os contigs formados apresentaram um total de 248 polimorfismos (236 SNPs e 12 INDELs), sendo 201 na região codante (127 não sinônimos e 74 sinônimos). A frequência dos polimorfismos foi maior nas regiões UTRs (1pol/54pb), em relação à codante (1pol/81pb). A análise das sequências de C. arabica permitiu a identificação de 2 subgrupos diferentes de sequências, referentes aos seus genomas ancestrais (C. canephora e C. eugenioides). Foi observada a presença de 67,4% dos polimorfismos entre os grupos ancestrais e 32,6% dentro dos grupos em C. arabica. Esses resultados vêm permitindo definir genes tanto para estudos de expressão de homeólogos de CGAs como para o desenvolvimento de marcadores moleculares para o mapeamento genético.Item Nucleotide diversity of genes related to chlorogenic acid biosynthesis of coffea(Editora UFLA, 2013-04) Ivamoto, Suzana Tiemi; Pot, David; Lannes, Sergio Dias; Domingues, Douglas Silva; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Pereira, Luiz Filipe ProtasioChlorogenic acids (CGAs) are important chemical compounds of Coffea spp. related to beverage quality as they affect its astringency and can change its aroma and flavor. About 310,000 Coffea Expressed Sequence Tags (ESTs) are available and provide access to the nucleotide variability of the plant and to the development of molecular markers linked to beverage quality for the main enzymes involved in biosynthesis of the CGAs: PAL, C4H, 4CL, CQT and C3’H. In this study we identified SNP, INDELS and SSR polymorphisms within the nucleotide sequences available from the Brazilian Coffee Genome database and from the NCBI. The EST sequences for CGAs were trimmed and clustered by the program Codon Code Aligner, and polymorphisms and their validation detected (chromatogram quality). We identified six isoforms for PAL, one for C4H, six for 4CL, two for CQT and two for C3’H. The contigs formed exhibited a total of 248 polymorphisms (236 SNPs and 12 INDELs), with 201 in the coding region (127 non-synonymous and 74 synonymous). The frequency of polymorphisms was greater in the UTR regions (1pol/54pb) in relation to the coding region (1pol/81pb). The analysis of C. arabica sequences allowed identification of two different subgroups of sequences, related to their ancestral genomes (C. canephora and C. eugenioides). The presence of 67,4% of the polymorphisms between the ancestral groups and 32,6% within the groups were observed em C. arabica . The characterization of nucleotide diversity on those genes is essential for further studies on differential expression of their homeologs, as well as the use of CGAs as molecular markers related to genetic mapping.Item Expressão gênica em larga escala de raizes de Coffea arabica L.(Embrapa Café, 2015) Santos, Tiago Benedito dos; Silva, Juliana Costa; Soares, João Danillo Moura; Baba, Viviane Yumi; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Domingues, Douglas SilvaA utilização de novas tecnologias de sequenciamento em larga escala (454-mRNAseq) é uma frente inovadora de estudos para a biotecnologia do cafeeiro, promovendo a identificação e caracterização de novos componentes genômicos de interesse. Mudas de cafeeiro foram mantidas sob supressão de fontes nitrogenadas e suas raízes foram utilizadas para construção de bibliotecas de cDNA, que foram sequenciados utilizando a plataforma GS-FLX Titanium da Roche. Foram gerados um total 809.517 reads, os quais geraram 34.654 contigs. Por meio dos transcritos gerados pelo mRNAseq de raiz espera-se identificar e caracterizar molecularmente os genes envolvidos no transporte e metabolismo de nitrogênio no cafeeiro.