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Item Análise funcional do gene órfão CcUNK8 de Coffea canephora via transformação genética de Setaria viridis(Universidade Federal de Lavras, 2014-07-30) Duarte, Karoline Estefani; Marraccini, Pierre RogerO cafeeiro é um dos mais valiosos produtos primários no comércio mundial. Em razão dessa importância econômica, o cafeeiro vem sendo alvo de programas de melhoramento genético visando à introdução de novos caracteres para obtenção de plantas com características agronômicas superiores, por exemplo, com uma maior tolerância à seca. Porém, como melhoramento convencional do cafeeiro é demorado, o uso das últimas técnicas de genômica está sendo desenvolvido para acelerar a criação de novas plantas. Assim, o sequenciamento do genoma e, também, o sequenciamento em larga escala de genes expressos (RNAseq) torna-se algo necessário para analisar o determinismo genético da tolerância à seca e identificar genes candidatos (GCs) atuantes neste determinismo. No cafeeiro, mas também em outras plantas como Arabidopsis thaliana, Oryza sativa e microrganismos, pelas análises dos projetos de sequenciamento demostra-se uma alta porcentagem (cerca de 20- 30%) de genes considerados no hits, ou seja, genes para os quais nenhuma similaridade com as sequências depositadas nos bancos de dados é encontrada. Em Coffea canephora e Coffea arabica foram identificados e caracterizados alguns genes no hits. Alguns desses genes possuem um perfil de expressão onde se observa in silico uma distribuição heterogênia quanto a tecidos e tratamentos utilizados, como é o caso do no hit 33656. Infere-se que no hits possam ter se originado de processos de especiação, portanto poderiam estar interligados a vias de resposta únicas de organismos tolerantes ou susceptíveis a uma dada condição. Pelos dados de qPCR mostra-se que o no hit CcUNK8 apresentou maior expressão em folhas estressadas quando comparado a folhas controle de C. canephora sendo um gene canditado à tolerância à seca e foi, então, selecionado para transformação genética utilizando Setaria viridis como planta modelo.O T-DNA contendo o gene CcUNK8 foi inserido em plantas de Setaria viridis via Agrobacterium tumefaciens e a expressão deste gene foi quantificada por meio de qPCR nos eventos primários de transformação. Em alguns eventos foi observado um acúmulo de biomassa maior de parte aérea e radicular que indivíduos não transformados. Foram observadas, ainda, diferenças no acúmulo de biomassa entre o mesmo evento quando submetido ao tratamento irrigado e não-irrigado.Item Análise funcional da região promotora de haplótipos do gene CcDREB1D de Coffea canephora via transformação genética de Nicotiana tacabum cv. SRI(Universidade Federal de Lavras, 2014-02-28) Aquino, Sinara Oliveira de; Marraccini, Pierre RogerEstudos recentes resultaram na identificação de vários genes candidatos para tolerância à seca que apresentaram expressão diferencial contrastante entre genótipos. Dentre esses, encontram-se genes integrantes da via de resposta ao estresse hídrico, tais como os fatores de transcrição DREB. Resultados da expressão do gene CcDREB1D nas folhas dos clones 14 (tolerante) e 22 (sensível) de Coffea canephora Conilon mostraram uma maior expressão desse gene em condição de défice hídrico no clone 14 comparado ao clone 22. Após sequenciamento, polimorfismos na região promotora do gene CcDREB1D, que podem indicar a participação de três haplótipos (15, 16 e 17) no controle genético da tolerância à seca, foram identificados nos clones 14 e 22. Visando estudar a participação dos polimorfismos na resposta à seca, várias construções gênicas, com diferentes fragmentos da região promotora do gene CcDREB1D, foram arquitetadas no vetor binário pBI101 e testadas via transformação genética de Nicotiana tabacum cv. SRI, a fim de avaliar a capacidade dos fragmentos de controlarem a expressão do gene repórter β-glucuronidase (uidA). Testes histoquímicos indicaram uma forte atividade GUS (forte coloração) correspondente ao controle positivo (pBI121) enquanto que nenhuma atividade GUS foi detectada para o controle negativo (pBI101). Tanto nas folhas, como nas raízes, uma expressão basal do gene uidA foi verificada nas plantas T0 sem estresse, sobretudo para as construções contendo as versões mais longas (D) do pDREB1D. Para verificar se a região promotora dos haplótipos do gene CcDREB1D responderiam aos estresses abióticos, as plantas transformadas de tabaco foram submetidas a ensaios de desidratação e de temperatura elevada e a expressão do gene repórter uidA foi analisada por testes histoquímicos GUS e PCR quantitativa em tempo real (qPCR). Experimentos de qPCR confirmaram uma leve indução do gene uidA nas folhas das plantas T0 transformadas com pD22-hp17D. No entanto, os níveis de expressão deste gene foram muito inferiores aos das plantas transformadas com o controle positivo (pBI121). Nenhuma indução do gene repórter foi observada nas plantas transformadas com as diferentes construções contendo os outros haplótipos (15 e 16) do promotor CcDREB1D. Contudo, esses resultados mostraram que (1) os promotores pDREB1D de C. canephora são fracos em tabaco, (2) o promotor do haplótipo 17 oriundo do clone 22 de C. canephora é induzido com estresses abióticos nas folhas de tabaco, mostrando que os mecanismos moleculares implicados na regulação da expressão gênica em resposta à seca são (pelo menos parcialmente) conservados entre cafeeiro e tabaco, e que (3) o funcionamento dos promotores pDREB1D dos clones 14 e 22 de cafeeiro é diferencial em tabaco, sugerindo que os polimorfismos identificados nesses promotores participam da regulação destas sequências.