Teses e Dissertações
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Item Caracterização de raças fisiológicas e análise de proteínas candidatas a efetoras em população de Hemileia vastatrix no Brasil(Universidade Federal de Viçosa, 2017) Silva, Rosemeire Alves; Zambolim, LaércioA ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo Hemileia vastatrix Berkeley & Broome, é considerada a principal doença da cultura. O fungo está amplamente distribuído nas regiões produtoras de café, causando severos danos econômicos. Novas raças fisiológicas de H. vastatrix tem surgido, com frequência em todo mundo, infectando algumas cultivares de café lançadas comercialmente como resistentes à ferrugem. Dessa forma, a obtenção de cafeeiros resistentes tem sido um desafio devido ao alto potencial adaptativo do fungo e tem se tornado cada vez mais difícil a caracterização dos patótipos por meio da coleção de cafeeiros diferenciadores de raça. Além disso, as informações acerca da interação de cafeeiros com as raças existentes são escassas, embora o processo infeccioso de H. vastatrix seja bem estudado. Estudos genômicos estão ajudando no entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos no processo de interação entre planta e patógeno e no desenvolvimento de técnicas moleculares para a identificação de isolados. Nosso objetivo foi caracterizar as raças de H. vastatrix encontradas nas principais regiões produtoras de café do Brasil, e estudar as proteínas candidatas a efetoras preditas para H. vastatrix que possam contribuir para patogenicidade nas diferentes raças do fungo. Foram utilizados 56 isolados monopustular coletados de diferentes espécies de café, Coffea canephora, C. arabica e Híbrido de Timor (C. canephora x C. arabica) e multiplicados em cafeeiro suscetível C. arabica variedade Caturra. Cada isolado foi inoculado em cafeeiros que compõe a série diferenciadora de raças, com três repetições. O DNA dos 56 isolados monopustulares foram extraídos para os estudos genômico. Foram utilizadas 47 combinações de primer para amplificar genes de candidatos a efetores. Sete genes foram amplificados, sequenciados e tiveram sua expressão validada em cafeeiros resistente e suscetível. As sequências obtidas foram alinhadas para os 46 isolados, usando o programa DNA Baser. Estudo de domínio conservado foram realizados no programa Pfam e a categorização das proteínas no Blast2GO. O alinhamento das sequências de nucleotídeos, proteínas e agrupamento dos isolados foi feito no programa Clustalw e as diferença de nucleotídeo foi analisada no Weblogo. Os dados obtidos foram usados para o estudo de diversidade. Por meio da inoculação na série diferenciada, foram identificadas sete raças, sendo cinco já descritas no Brasil e duas pela primeira vez (raça XXIX e XXX). Não foi possível caracterizar 15 combinações dos genes de virulência, sendo assim consideradas novas raças. A análise da coleção de isolados permitiu inferir a presença de pelo menos seis novos genes na série diferenciadora, o que possibilitou diferenciar dois isolados descritos como raças III. Na análise genômica, os 47 genes candidatos a efetores estudados se mostraram conservados em todos os isolados e estão ligados a 15 processos biológicos do desenvolvimento do fungo. Foram identificados 14 domínios nas proteínas provenientes desses genes. Para os sete genes sequenciados nos diferentes isolados, observou-se diferença na sequência dos nucleotídeos e presença de indivíduos heterozigoto e homozigoto. Com análise de diversidade foi possível discriminar os indivíduos, sendo o isolado Hv-09 o mais divergente. As informações geradas nesta pesquisa poderão ampliar o entendimento da interação entre H. vastatrix e o cafeeiro. O conhecimento dos genes que estão envolvidos no processo infeccioso auxiliará o entendimento dos mecanismos moleculares que levam à suplantação da resistência por novas raças do fungo.Item Fosfitos e subprodutos da indústria cafeeira nas respostas bioquímicas e moleculares de defesa do tomateiro à mancha bacteriana(Universidade Federal de Lavras, 2014-06-17) Costa, Josineide Rodrigues da; Resende, Mário Lúcio Vilela deA mancha-bacteriana causada por Xanthomonas perforans tem causado prejuízo econômico para a cultura do tomateiro no Brasil. O uso de indutores de defesas das plantas é uma alternativa que atende aos requisitos do manejo integrado de doenças. Objetivou-se, neste trabalho, avaliar o efeito de formulações de fosfitos e extratos vegetais na proteção do tomateiro à mancha- bacteriana e seus componentes de resistência, como a expressão de genes e a atividade de enzimas envolvidas no processo de defesa das plantas. Mudas de tomateiro foram pulverizadas com Kasumin ® , Kocide ® , Fulland ® , Reforce Cu ® , Reforce K ® , Green Fós ® , Reforce Zn ® , Green Force Cuca ® ,Green Force S ® , ET 64 ® , Big Red ® , Green Force KP ® nas suas respectivas doses indicadas para campo e inoculadas quatro dias depois com Xanthomonas perforans. O efeito tóxico direto dos produtos in vitro, foi testado nas mesmas concentrações utilizadas no experimento in vivo, além de 50 e 25% das doses de cada produto utilizado. Os produtos foram adicionados ao meio de cultura Kado 523 e após a solidificação dos meios, foram inseridos 10 μL de suspensão bacteriana, sendo verificado o efeito tóxico pela inibição do crescimento da bactéria. Para a avaliação dos componentes de defesa da planta, foram determinadas as atividades das enzimas peroxidases (POX), catalases (CAT), ascorbato peroxidases (APX), superóxido dismutases (SOD) e fenilalanina amônia-liases (PAL). Realizou-se também a análise do efeito do Fulland ® e do Green Force CuCa ® sobre o perfil da expressão gênica dos genes CAT, SOD, PAL e POX. Os tratamentos Green Force Cuca ® , Fulland ® e Reforce Zn ® proporcionaram a maior proteção do tomateiro contra a mancha-bacteriana. Com relação ao experimento in vitro, Xanthomonas perforans demonstrou resistência ao antibiótico casugamicina em todas as concentrações testadas e sensibilidade aos produtos com formulações à base de nutrientes, de subprodutos da indústria cafeeira, hidróxido de cobre e estreptomicina. Observou-se também que os produtos Green Force CuCa ® e Fulland ® induziram as respostas de defesa das plantas de tomateiro contra mancha-bacteriana, pois a atividade das enzimas POX, CAT, APX foi maior antes e após a inoculação. Já a enzima superóxido dismutase teve sua atividade aumentada somente após a inoculação. A atividade da PAL não foi aumentada nas plantas de tomateiro em momento algum. Esses resultados demostraram o efeito aditivo da expressão gênica dos genes que codificam para as enzimas da CAT, SOD, PAL e POX, na presença de indutores Green Force CuCa ® e Fulland ® e inoculados com a fitobactéria em mudas de tomateiro.Item Seleção assistida por marcadores moleculares para resistência múltipla à ferrugem e à antracnose dos frutos do cafeeiro(Universidade Federal de Viçosa, 2013-07-23) Alkimim, Emilly Ruas; Caixeta, Eveline TeixeiraMarcadores moleculares intimamente ligados a dois genes maiores (S H 3 e S H ?) que conferem resistência à ferrugem, e marcadores moleculares ligados ao gene Ck-1 que confere resistência à antracnose dos frutos do cafeeiro também conhecida por Coffee Berry Disease (CBD), foram previamente identificados. Estes marcadores apresentam potencial para serem usados em programas de melhoramento visando identificar e monitorar genótipos contendo genes de resistência a esses patógenos (Hemileia vastatrix e Colletotrichum kahawae). Dessa forma, o objetivo do trabalho foi utilizar a estratégia de seleção assistida por marcadores moleculares associados aos genes S H 3 (proveniente de Coffea liberica), S H ? (proveniente do Híbrido de Timor-UFV 443-03) e Ck-1, no programa de melhoramento do cafeeiro da Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais (Epamig)/Universidade Federal de Viçosa (UFV). Inicialmente os marcadores moleculares disponíveis na literatura foram validados e então utilizados na seleção assistida de 160 genótipos. Esses cafeeiros fazem parte do germoplasma da UFV/Epamig e foram introduzidos do CIFC por serem potencialmente portadores de resistência à ferrugem. Por meio dos marcadores validados foi possível identificar onze indivíduos resistentes homozigotos para o gene S H 3, UFV311-48 (F 2 ), UFV311-49 (F 2 ), UFV 311-56 (F 2 ), UFV313-133 (F 2 ), UFV329-72 (F 2 ), UFV329-78 (F 2 ), UFV334-65 (F 2 ), UFV335-12 (F 2 ), UFV335-77 (F 2 ), UFV399-45 (F 2 ) e UFV409-08 (F 2 ). O gene S H 3 confere resistência a diferentes raças de H. vastatrix e a sua incorporação em variedades de interesse tem sido sugerida como importante estratégia para obter resistência à ferrugem. Também foram identificados cafeeiros que além se serem portadores do gene S H 3 em homozigose, apresentaram o gene S H ? proveniente do Híbrido de Timor (UFV443-03). Tais genótipos são o UFV311-48 (F 2 ), UFV311-49 (F 2 ), UFV 311-56 (F 2 ), UFV313-133 (F 2 ), UFV334-65 (F 2 ), UFV399-45 (F 2 ) e UFV409-08 (F 2 ). Para o gene Ck-1 que confere resistência à CBD, foi observado que o genótipo UFV328-60 (F 2 ) foi homozigoto resistente quando analisado com os dois marcadores, apesar de não apresentar bandas ligadas aos genes S H 3 e S H ?. Entretanto UFV317-12 (F 1 ) se mostrou resistente heterozigoto com o marcador CBD-Sat235 (marcador do Ck-1) e resistente homozigoto com o marcador CBD-Sat207 (outro marcador do Ck-1), e portador do gene S H ? que confere resistência à ferrugem. Logo, por meio da Seleção Assistida por Marcadores Moleculares foram identificados cafeeiros portadores de diferentes genes de resistência à ferrugem e à CBD. Esse germoplasma, apesar de ser derivado de C. liberica, apresentou além do gene S H 3 o gene S H ?, até então identificado apenas em genótipos derivados de C. canephora. Os cafeeiros identificados poderão ser utilizados em cruzamentos para a introdução desses genes em outros materiais genéticos de interesse nos programas de melhoramento. A utilização dos marcadores moleculares validados, nos programas de melhoramento, serão imprescindíveis para monitoramento dos genes nas diferentes gerações e cruzamentos.Item Isolamento e caracterização de genes da família SnRK e sua expressão em resposta ao déficit hídrico em Coffea canephora(Universidade Federal de Viçosa, 2009-09-14) Paiva, Rita Márcia Cardoso de; Loureiro, Marcelo EhlersA tolerância à seca é o resultado de numerosas características anatômicas, morfológicas e fisiológicas, de natureza constitutiva ou indutiva. Como um dos principais hormônios de plantas, o ácido abscísico (ABA) tem sido extensivamente estudado e vários destes estudos têm demonstrado que o ABA é responsável por diversas respostas adaptativas ao déficit hídrico. Desta forma, o isolamento e estudo da expressão de genes que participam de vias de sinalização em resposta a ABA podem fornecer dados importantes para a compreensão de sua função e de sua importância no mecanismo de tolerância à seca em café. Este trabalho teve como objetivos identificar, a partir do banco do café, genes pertencentes à família SnRK além de verificar a resposta dos mesmos em folhas e raízes de clones de Coffea canephora, em condições de déficit hídrico severo e moderado. Mudas dos clones 120 (genótipo tolerante ao déficit hídrico) e 109A (genótipo sensível) foram cultivadas em vasos de 12 L e o déficit hídrico foi alcançado suspendendo a irrigação até que as plantas atingissem um potencial hídrico de antemanhã de -1,5 MPa e -3,0 MPa. Análises de homologia utilizando o programa Blast, permitiram a identificação de 24 contigs que podem representar possíveis genes da família SnRK em café, sendo 3 contigs da subfamília SnRK1, 5 contigs pertencentes a subfamília SnRK2 e 16 sequências da subfamília SnRK3. Dentre as sequências identificadas, destacam-se 2 contigs, 15120 e 12770, que nesta investigação, demonstrou-se que correspondem a regiões distintas de um mesmo gene, homólogo a SnRK2.6 de Arabidopsis e denominado cnSnRK2.6. Desta forma, foi obtida a sequência completa deste gene que foi eficientemente colocado em vetor de transformação de plantas. Neste estudo, identificou-se também uma parte da região promotora deste gene. Análises de expressão, feitas por RT-PCR em Tempo Real, permitiu verificar que a expressão de alguns genes desta família são alteradas em condições de déficit hídrico, tanto em folhas como em raízes. Em folhas, os genes SnRK2.4, CIPK6 e CIPK9 são induzidos, enquanto os genes SnRK2.3, CIPK3, CIPK8, CIPK10 e CIPK11 são reprimidos pela condição de seca. Já em raízes, observou-se que os genes SnRK2.3, SnRK2.8, CIPK6, CIPK8 e CIPK9 são induzidos, o que demonstra que alguns genes apresentaram comportamento diferenciado nesses dois órgãos. Em adição, foi também verificado a expressão destes genes em resposta à ABA, estresse osmótico e estresse salino. Para isso, foi testado um novo sistema experimental, com uso de folhas destacadas de cafeeiro, que se mostrou uma forma rápida e eficiente para estudos em plantas de café. Os resultados obtidos mostraram uma redução da condutância estomática (g s ) que foi acompanhada de reduções nas taxas de assimilação líquida do carbono (A) para os tratamentos com ABA e manitol, enquanto no tratamento controle nenhuma alteração foi observada. A análise de expressão gênica, demonstrou que muitos desses genes respondem a ABA, estresse osmótico e estresse salino. SnRK2.6 é induzido por ABA e manitol, mas não por salinidade. Coletivamente, estes resultados sugerem que os genes SnRKs caracterizados constituem proteínas quinases envolvidas na resposta a estresses abióticos.Item Seleção assistida por marcadores moleculares para resistência múltipla à ferrugem e à antracnose dos frutos do cafeeiro(Universidade Federal de Viçosa, 2013-07-29) Alkimim, Emilly Ruas; Caixeta, Eveline TeixeiraMarcadores moleculares intimamente ligados a dois genes maiores (SH3 e SH?) que conferem resistência à ferrugem, e marcadores moleculares ligados ao gene Ck-1 que confere resistência à antracnose dos frutos do cafeeiro também conhecida por Coffee Berry Disease (CBD), foram previamente identificados. Estes marcadores apresentam potencial para serem usados em programas de melhoramento visando identificar e monitorar genótipos contendo genes de resistência a esses patógenos (Hemileia vastatrix e Colletotrichum kahawae). Dessa forma, o objetivo do trabalho foi utilizar a estratégia de seleção assistida por marcadores moleculares associados aos genes SH3 (proveniente de Coffea liberica), SH? (proveniente do Híbrido de Timor-UFV 443-03) e Ck-1, no programa de melhoramento do cafeeiro da Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais (Epamig)/Universidade Federal de Viçosa (UFV). Inicialmente os marcadores moleculares disponíveis na literatura foram validados e então utilizados na seleção assistida de 160 genótipos. Esses cafeeiros fazem parte do germoplasma da UFV/Epamig e foram introduzidos do CIFC por serem potencialmente portadores de resistência à ferrugem. Por meio dos marcadores validados foi possível identificar onze indivíduos resistentes homozigotos para o gene SH3, UFV311-48 (F2), UFV311-49 (F2), UFV 311-56 (F2), UFV313-133 (F2), UFV329-72 (F2), UFV329-78 (F2), UFV334-65 (F2), UFV335-12 (F2), UFV335-77 (F2), UFV399-45 (F2) e UFV409-08 (F2). O gene SH3 confere resistência a diferentes raças de H. vastatrix e a sua incorporação em variedades de interesse tem sido sugerida como importante estratégia para obter resistência à ferrugem. Também foram identificados cafeeiros que além se serem portadores do gene SH3 em homozigose, apresentaram o gene SH? proveniente do Híbrido de Timor (UFV443-03). Tais genótipos são o UFV311-48 (F2), UFV311-49 (F2), UFV 311-56 (F2), UFV313-133 (F2), UFV334-65 (F2), UFV399-45 (F2) e UFV409-08 (F2). Para o gene Ck-1 que confere resistência à CBD, foi observado que o genótipo UFV328-60 (F2) foi homozigoto resistente quando analisado com os dois marcadores, apesar de não apresentar bandas ligadas aos genes SH3 e SH?. Entretanto UFV317-12 (F1) se mostrou resistente heterozigoto com o marcador CBD-Sat235 (marcador do Ck-1) e resistente homozigoto com o marcador CBD-Sat207 (outro marcador do Ck-1), e portador do gene SH? que confere resistência à ferrugem. Logo, por meio da Seleção Assistida por Marcadores Moleculares foram identificados cafeeiros portadores de diferentes genes de resistência à ferrugem e à CBD. Esse germoplasma, apesar de ser derivado de C. liberica, apresentou além do gene SH3 o gene SH?, até então identificado apenas em genótipos derivados de C. canephora. Os cafeeiros identificados poderão ser utilizados em cruzamentos para a introdução desses genes em outros materiais genéticos de interesse nos programas de melhoramento. A utilização dos marcadores moleculares validados, nos programas de melhoramento, serão imprescindíveis para monitoramento dos genes nas diferentes gerações e cruzamentos.