Teses e Dissertações
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Item Estudo de dois genes de café (Coffea arabica) induzidos por estresse biótico e análise de suas regiões promotoras(Instituto de Biociências de Botucatu - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, 2013) Severino, Fábio Eduardo; Maia, Ivan de GodoyA disponibilidade de promotores órgão/tecido-específicos responsáveis pela regulação de genes responsivos a estresses bióticos e abióticos constitui uma ferramenta fundamental para os programas de melhoramento genético do café (Coffea arabica) visando o incremento de resistência e tolerância. Relatamos aqui a caracterização de um promotor do gene que codifica uma provável peroxidase III em C. arabica (CaPrx), peroxidases da classe III (Prxs) são enzimas envolvidas numa variedade de processos fisiológicos relacionados com o estresse em plantas. A CaPrx é expressa em estágios iniciais da interação com o nematóide de galha (RKN). CaPrx mostrou expressão aumentada nas raízes de café inoculadas com RKN (Meloidogyne paranaensis) (12 h após a inoculação), mas nenhuma diferença significativa foi observada na expressão entre as plantas suscetíveis e resistentes. Ensaios com plantas de tabaco transgênicas portadoras do promotor CaPrx fusionado com o gene que codifica a β-glucuronidase (GUS), revelou que este promotor foi exclusivamente ativo nas galhas induzidas por RKN (Meloidogyne javanica). Em seções transversais de galhas, o repórter GUS foi detectado predominantemente em células gigantes. Um aumento na expressão do gene GUS em raízes de tabaco transgênicos foi detectado 16 horas pós-inoculação por RKN. Por outro lado, nenhuma alteração na expressão de GUS após tratamento com ácido jasmônico foi detectada. Um segundo estudo foi realizado a fim de desvendar o papel de um fator WRKY de café (CaWRKY1) na regulação do promotor do gene que codifica uma isoflavona redutase em café (CaIRL). Fatores de transcrição do tipo WRKY estão envolvidos na regulação da expressão de diversos genes de defesa em plantas. A região promotora do gene CaIRL possui diversos sítios W-boxes ao longo de sua sequência. Através de análises de deleção e ensaios de transativação verificou-se que o fator CaWRKY1 foi capaz de transativar o promotor do gene CaIRL sendo que a modulação da resposta parece estar relacionada com a presença dos W-boxes na região promotora.Item Análise de expressão gênica de membros da família Saur durante a embriogênese somática de Coffea arabica(Universidade Federal de Lavras, 2017-04-17) Zanin, Fabiana Couto; Diniz, Leandro Eugenio CardamoneTendo em vista a importância do processo de embriogênese somática para a obtenção em larga escala de embriões produtivos selecionados e para pesquisas de melhoramento genético, o presente trabalho objetivou-se por caracterizar os genes SAUR em Coffea canephora e analisar a expressão gênica de alguns membros da família durante a embriogênese somática, além de especular suas possíveis funções. A análise in silico da família gênica foi realizada a partir da comparação de proteínas SAUR já caracterizadas em outras espécies com sequências de café distribuídas no banco de dados Coffee Genome Hub, que passaram por análise de redundância e presença do domínio conservado característico dos genes. Foi construída uma biblioteca de transcritos de C. arabica a partir de amostras de cDNA de calos não embriogênicos (CNE), calos embriogênicos (CE) e suspensões celulares (ECS) sequenciadas, onde foram identificados genes SAUR diferencialmente expressos. O perfil de expressão foi então analisado por RT-qPCR em amostras de C. arabica. Em C. canephora foram encontrados 31 membros da família SAUR, destes, 8 encontraram-se diferencialmente expressos nas bibliotecas sequenciadas e o perfil dos genes SAUR5, 12, 13, 18 e 20 foram analisados in vivo no presente trabalho. Ainda são necessários estudos mais aprofundados para determinar as funções de cada um dos genes analisados durante a embriogênese somática, mas os resultados obtidos parecem estar de acordo com outros estudos de que os genes SAUR são induzidos por auxina e estão, em grande parte, envolvidos com expansão e elongação celular.Item Seleção de genes de referência e perfis de expressão gênica da família LAV durante a embriogênese somática em cafeeiro(Universidade Federal de Lavras, 2015-02-26) Freitas, Natália Chagas; Paiva, Luciano VilelaVisando contribuir para a compreensão do processo de indução da embriogênese somática, fundamental para o desenvolvimento de protocolos de regeneração mais eficientes, objetivou-se com esse trabalho identificar, caracterizar e analisar os padrões de expressão dos genes da família LAV durante a embriogênese somática indireta de Coffea arabica L. a partir da normalização de dados de RT- qPCR com genes de referência adequados. A correlação da expressão dos genes com o potencial embriogênico foi realizada comparativamente com o auxílio de análises histológicas e regeneração de embriões somáticos em duas linhagens independentes de suspensões celulares. Primeiramente, foi analisada a estabilidade de expressão de doze candidatos a genes de referência (24S, ACT, GAPDH, CYCL, EF1a, TUB, PP47, PP2A, RPL39, APRT, UBQ, 14-3-3) em diferentes tecidos e fases de desenvolvimento relacionados a embriogênese somática do cafeeiro. As análises foram realizadas através da ferramenta RefFinder que compila os algoritmos estatísticos geNorm, NormFinder, BestKeeper e Delta-Ct. Os resultados obtidos sugerem que não há um gene de referência universal adequado para todas as variáveis experimentais. A expressão mais estável em calo não embriogênico, calo embriogênico e suspensão celular em diferentes tempos de cultivo correspondeu aos genes UBQ, ACT e APRT, respectivamente. O gene RPL39 apresentou maior estabilidade na análise em conjunto de calos não embriogênicos e embriogênicos. Enquanto em plântula e embrião nos diferentes estádios, PP2A apresentou maior estabilidade de expressão. A análise em conjunto de todas as amostras indicou que 24S e PP2A são os genes de referência mais adequados para normalização de dados de RT-qPCR. Com o auxílio de ferramentas de bioinformática, foram identificados apenas três possíveis ortólogos de VAL2 (C15, SEA1 e SIC1) dentre os genes da família LAV. Os perfis de expressão verificados in vivo diferiram dos obtidos in silico, os dados mostraram expressão quantitativa relativa variável do C15 e SIC1 em todas as amostras analisadas e ausência de expressão de SEA1 em todos os tecidos. Não foi verificado relação dos níveis de expressão de C15 e SIC1 com o potencial embriogênico. As linhagens de suspensões celulares apresentaram o mesmo padrão histológico e aumento da taxa de regeneração em função do tempo de cultivo. O bom desenvolvimento das plântulas obtidas a partir do protocolo utilizado pode ser reflexo da alta expressão de VAL2 nos embriões cotiledonares. O conhecimento da expressão de VAL2 abre perspectiva para a melhoria do sistema de propagação via embriogênese somática, visando assegurar a conversão de embriões em plântulas normais.Item Análise da expressão dos genes Baby Boom (BBM) e Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinase (SERK) envolvidos na embriogênese somática do cafeeiro (Coffea arabica L.)(Universidade Federal de Lavras, 2011-02-25) Silva, Anderson Tadeu; Paiva, Luciano VilelaRetrata-se, neste estudo, os genes identificados e caracterizados na embriogênese somática de Coffea arabica L. cv Catiguá conduzidos no Laboratório Central de Biologia Molecular (LCBM), na Universidade Federal de Lavras (UFLA), Minas Gerais. A embriogênese somática – formação do embrião a partir de células somáticas é um mecanismo de reprodução assexuada natural em algumas espécies vegetais, mas que pode ser induzido in vitro de modo generalizado. Análises histológicas das características diferenciadoras entre células somáticas e embriogênicas podem ser usadas para aumentar a eficiência metodológica, porém, não permitem o diagnóstico dos eventos indutores da transição entre essas características e, portanto, o estudo e obtenção de marcadores moleculares ligados aos eventos de transição são de extrema utilidade. Nesse contexto, foi avaliada a expressão in silico e in vitro dos genes SERK (Somatic Embryogensesis Receptor Kinase) e BBM (Baby Boom), envolvidos no processo de transição do estado vegetativo para o embriogênico, visando à expressão diferencial “in vitro” e também a busca por um marcador molecular, mediante análises in silico. No artigo 1 apresenta-se a expressão diferencial do gene SERK nos estágios de calos embriogênicos, calos não embriogênicos e suspensão celular. Um total de três ESTs-contigs foram analisados, em que o ESTs-contig 166 apresentou, em sua expressão, características diferenciadas para a embriogênese de café. Esses dados sugerem que o ESTs-contig 166 seja o possível ortólogo de SERK em C. arabica (CaSERK) e indicam que essa estratégia pode aumentar ainda mais a eficiência metodológica para a obtenção de suspensão de células embriogênicas - ECS, em outras espécies e cultivares . No artigo 2 apresenta-se a expressão diferencial do gene BBM nos estágios de calos embriogênicos, calos não embriogênicos e suspensão celular. Um total de dois ESTs-contigs foram analisados, em que o ESTs-contigs 9 apresentou uma alta e exclusiva expressão nos estágios de calos embriogênicos e suspensão celular, em relação aos calos não embriogênicos. Esses dados sugerem que ESTs-contig 9 seja o possível ortólogo de BBM em C. arabica (CaBBM) e indicam que o uso dele como marcador molecular pode aumentar ainda mais a eficiência metodológica durante a obtenção de materiais embriogênicos de cafeeiro. Pelo artigo 3 indica-se uma relação transiente de indução e retroinibição entre CaBBM e CaSERK durante a curva de crescimento das ECS, na qual a expressão diametralmente opostas entre eles coincide com a estabilização da taxa de crescimento das ECS. No artigo 4 apresenta-se a possíbilidade de cinco ESTs-contigs identificados in silico nas bibliotecas de cafeeiro, também serem usados como marcadores do processo de aquisição embriogênica.