Trabalhos de Evento Científico
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Item Caracterização de promotores de Coffea spp. via transformação genética em planta modelo(Embrapa Café, 2019-10) Girotto, Larissa; Ivamoto-Suzuki, Suzana Tiemi; Oliveira, Fernanda Freitas de; Aryoshi, Caroline; Santos, Tiago Benedito dos; Pereira, Luiz Filipe ProtasioAs mudanças climáticas globais têm causados danos a produtividade agrícola cafeeira com impactos econômicos e sociais, e apresentam o potencial de reduzir áreas disponíveis para o plantio de cafeeiros. Diante deste cenário foi investigado o potencial do promotor da galactinol sintase (GolS) do gênero Coffea, que catalisa a primeira etapa da via de síntese de oligossacarídeos da família da Rafinose, cujo acúmulo ocorre principalmente em resposta a estresses abióticos. Entender a estrutura e composição de sequências gênicas promotoras de cafeeiros é de fundamental importância para compreender melhor os mecanismos genéticos e os processos de regulação da expressão gênica induzidos em períodos de estresse hídrico e salino. Neste estudo identificamos 14 promotores GolS presentes nos genomas de Coffea arabica, C. canephora e C. eugenioides. Dentro das regiões promotoras desses genes, foram observados 12 cis-elementos relacionados a regulação de genes em resposta a condições adversas, dentre eles: ARE, ABRE, MYB e STRE. Após a caracterização in silico dos 14 promotores, o promotor da isoforma de GolS3 (CcGolS3) de Coffea canephora (Cc) foi clonada com o objetivo de verificar o seu comportamento frente a estresses abióticos. Plasmídeos contendo a construção pCcGolS3::GUS (gene repórter da β-glucuronidase) foram inseridos em Arabidopsis thaliana via transformação genética com Agrobacterium tumefaciens. A coloração histoquímica do gene repórter GUS foi verificada em todos os tecidos de A. thaliana transformadas. Para analisar o comportamento deste promotor, as plantas de A. thaliana foram submetidas a estresses hídrico e salino in vitro (0h, 12h, 24h e 48h), os seus respectivos RNAs foram extraídos e a síntese de cDNA foi realizada para a quantificação da atividade transcricional do gene repórter GUS via RT-qPCR. Os nossos resultados indicaram que o promotor de CcGolS3 pode ser caracterizado como do tipo estresse-induzido, visto que o perfil transcricional do gene GUS diretamente proporcional ao tempo de duração dos estresses. O promotor do gene CcGolS3 apresenta um grande potencial para ser utilizado em projetos futuros de melhoramento genético de cafeeiros e obtenção de plantas mais tolerantes a estresses abióticos.Item Transcriptoma de C. arabica L. revela diferenças na expressão de genes envolvidos na biossíntese da rafinose(Embrapa Café, 2019-10) Ivamoto-Suzuki, Suzana Tiemi; Reis Junior, Osvaldo; Domingues, Douglas Silva; Santos, Tiago Benedito dos; Oliveira, Fernanda Freitas de; Girotto, Larissa; Ariyoshi, Caroline; Pot, David; Leroy, Thierry; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Carazzolle, Marcelo Falsarella; Pereira, Gonçalo Amarante Guimarães; Pereira, Luiz Filipe ProtasioCoffea arabica L. é uma cultura importante em vários países em desenvolvimento. Apesar de sua importância econômica, os dados do transcriptoma mínimo estão disponíveis para tecidos de frutas, especialmente o perisperma, onde vários compostos relacionados à qualidade do café são produzidos. Para compreender os aspectos moleculares relacionados ao desenvolvimento de frutos e grãos de café, relatamos uma análise transcriptoma em larga escala de folhas, flores e frutos. O sequenciamento da Illumina (RNA-seq) resultou em 41.881.572 sequências trimadas com alta qualidade. A montagem de novo gerou 65.364 unigenes com um comprimento médio de 1.264 pb. Um total de 24.548 unigenes foram anotados como genes codificadores de proteínas, dos quais 12.560 sequências eram completas para esta codificação (full lenghts). No processo de anotação, identificamos nove genes candidatos relacionados à biossíntese de oligossacarídeos da família da rafinose (RFOs). Estes açúcares conferem osmoproteção e são acumulados durante o desenvolvimento inicial dos frutos. Quatro genes dessa via tiveram o seu padrão transcricional validado pela reação em cadeia da polimerase via transcrição reversa quantitativa em tempo real (RT-qPCR). Este atlas transcriptômico de C. arabica fornece um importante passo para a identificação de genes candidatos relacionados a diversas vias metabólicas do café, especialmente aquelas relacionadas à composição química dos frutos e a qualidade da bebida. Nossos resultados são o ponto de partida para aumentar o conhecimento sobre as proteínas do café que são produzidas durante os estádios de floração e desenvolvimento inicial dos frutos.Item Edição gênica de cafeeiro via CRISPR-Cas9: clonagem de sgRNAS de genes da biossíntese da cafeína(Embrapa Café, 2019-10) Oliveira, Fernanda Freitas de; Aryioshi, Caroline; Girotto, Larissa; Santos, Tiago Benedito dos; Tomaz, Juarez Pires; Pereira, Luiz Filipe ProtasioO café descafeinado apresenta uma demanda crescente do mercado consumidor, sendo portanto uma alternativa para produtores e indústria. Uma das alternativas de produção de cafés descafeinados é o silenciamento gênico via CRISPR-Cas9. O CRISPR-Cas9 é uma das ferramentas mais potentes e precisas de edição gênica, que consiste na utilização de um RNA guia (sgRNA) e de uma proteína Cas9 que reconhece regiões homólogas ao sgRNA e cliva o DNA, possibilitando o silenciamento do gene alvo. Visando iniciar trabalhos para produção de plantas de café descafeinado, neste trabalho apresentamos a estratégia de clonagem e produção de vetores CRISPR-Cas9 com sgRNAs para os genes da biossíntese da cafeína CaMXMT e CaDXMT Os sgRNAS foram desenhados na plataforma CRISPRdirect ® utilizando o C. canephora como genoma de referência. Dos 276 sgRNAs de MXMT e 317 de DXMT, foram selecionados os com menor número de off-targets e posicionados próximos a região terminal do genes, sendo três sgRNAs de cada gene: sgMXMT 1 , sgMXMT 2 , sgMXMT 3 , sgDXMT 1 , sgDXMT 2 , sgDXMT 3 . Para validar se os sgRNAs possuíam homologia com o genoma de C. arabica, foi realizado blast com o software BioEdit ® . Foi possível analisar através do alinhamento que os três sgRNAs de CaMXMT alinharam-se nos cromossomos “I” dos subgenoma de C. canephora e que sgMXMT 1 e sgMXMT 3 alinharam-se também no cromossomo “I” do subgenoma de C. eugenioides. Já os sgRNAs desenhados para CaDXMT, todos se alinharam ao cromossomo “A” no subgenoma de C. canephora. Apesar de não haver alinhamento no subgenoma de C. eugenioides, houve alinhamento no Scaffold 405, que contém a região gênica de DXMT de C. eugenioides, não sendo então um off-target. Os sgRNAs sgMXMT 1 e sgDXMT 1 foram ligados nos vetores pHAtc e pBAtc através de eletroporação. Foram positivadas por PCR 4 colônias para a ligação pHAtc/sgMXMT 1 , 3 para pHAtc/sgDXMT 1 e 2 para pBAtc/sgMXMT 1 . As colônias positivas na PCR foram também validadas por sequenciamento e detectou-se a inserção correta dos sgRNAs na posição esperada.Item Identificação e caracterização de genes relacionados à biossíntese de ácidos clorogênicos em Coffea arabica L.(Embrapa Café, 2015) Ivamoto, Suzana Tiemi; Sakuray, Leonardo Murai; Santos, Tiago Benedito dos; Pereira, Luiz Filipe ProtasioO Brasil é o maior produtor e exportador de café no cenário mundial, além de ser o segundo maior mercado consumidor da bebida, atrás apenas dos Estados Unidos. Pesquisas estão em desenvolvimento para aumentar o conhecimento genético de cafeeiros relacionada com a qualidade do produto. A qualidade da bebida é diretamente influenciada pelos compostos químicos presentes no grão de café, como por exemplo, ácidos clorogênicos (CGAs) que são relacionados à adstringência da bebida. Visando uma maior compreensão dos mecanismos moleculares e genéticos associados a produção dos CGAs, os objetivos deste trabalho são: i) identificar dos genes da via de biossíntese dos CGAs; ii) caracterizar o perfil transcricional in silico para alguns genes candidatos. Neste estudo foi utilizada uma montagem de Novo do transcriptoma de C. arabica e os seus respectivos 65,480 unigenes obtidos através de RNA-Seq de folhas, flores e de persiperma de frutos em diferentes fases de desenvolvimento. Foram identificados 45 genes candidatos para a via de biossíntese dos CGAs, os quais incluem todos os principais genes descritos para esta rota metabólica (fenilalanina amonialiase, cinamato 4-hidroxilase, 4 couramato CoA ligase, 4-couramato 3-hidroxilase, hidroxicinamoil quinato transferase e cafeoil-CoA O-metilttransferase).Item Expressão gênica em larga escala de raizes de Coffea arabica L.(Embrapa Café, 2015) Santos, Tiago Benedito dos; Silva, Juliana Costa; Soares, João Danillo Moura; Baba, Viviane Yumi; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Domingues, Douglas SilvaA utilização de novas tecnologias de sequenciamento em larga escala (454-mRNAseq) é uma frente inovadora de estudos para a biotecnologia do cafeeiro, promovendo a identificação e caracterização de novos componentes genômicos de interesse. Mudas de cafeeiro foram mantidas sob supressão de fontes nitrogenadas e suas raízes foram utilizadas para construção de bibliotecas de cDNA, que foram sequenciados utilizando a plataforma GS-FLX Titanium da Roche. Foram gerados um total 809.517 reads, os quais geraram 34.654 contigs. Por meio dos transcritos gerados pelo mRNAseq de raiz espera-se identificar e caracterizar molecularmente os genes envolvidos no transporte e metabolismo de nitrogênio no cafeeiro.Item Efeito da ferrugem e da supressão de nitrogênio no nível transcricional do gene nitrato redutase (CaNR) em Coffea arabica L.(Embrapa Café, 2013) Santos, Tiago Benedito dos; Baba, Viviane Yumi; Soares, João Danillo Moura; Carvalho, Kenia de; Braghini, Masako Toma; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Domingues, Douglas SilvaO objetivo do trabalho é avaliar se a ferrugem do cafeeiro (Hemileia vastatrix) pode modular a resposta transcricional de um gene-chave na assimilação de nitrogênio (N), a nitrato redutase, em função da restrição do nutriente e da resposta do cultivar ao patógeno. Sabe-se que o estado nutricional da planta pode influenciar a severidade do ataque por patógenos. A ferrugem no cafeeiro é um problema recorrente em todas as regiões de cultivo, afetando desde a produtividade até a qualidade final da bebida. A despeito da importância da nutrição mineral para a produtividade e seu impacto na resposta à ferrugem, existem poucos estudos relacionados ao estabelecimento da relação molecular entre o estado nutricional do cafeeiro e resposta de defesa a patógenos. Duas cultivares – uma resistente e uma suscetível à ferrugem do cafeeiro - foram submetidas a regimes diferenciais de N e inoculadas com H. vastatrix. A análise por qPCR do gene CaNR em três períodos pós-inoculação evidenciou padrões transcricionais distintos entre as duas cultivares - a cultivar suscetível apresentou um pico de expressão em período anterior a cultivar resistente. Este estudo preliminar evidencia que fatores genotípicos e nutricionais podem influenciar na atividade de genes relacionados ao metabolismo de N, dando suporte a futuras análises bioquímicas que auxiliem na compreensão de respostas fisiológicas e moleculares relacionadas com a interação da resposta de defesa e o estado nutricional.Item CONCENTRAÇÃO DE NUTRIENTES MINERAIS EM ACESSOS DA ETIÓPIA DE Coffea arabica(2011) Santos, Tiago Benedito dos; Meda, Anderson Rotter; Sitta, Renata Barrufaldi; Vespero, Eduardo Brandalize; Pavan, Marcos Antonio; Charmetant, Pierre; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Domingues, Douglas Silva; Embrapa - CaféO sucesso do manejo nutricional em plantas depende de diversos fatores, como características químicas, biológicas e físicas do solo, além da influência do genótipo. Apesar do manejo agronômico visando à adequação do solo para a cultura do cafeeiro estar bem estabelecido, pouco se sabe sobre o efeito do genótipo na absorção e acúmulo de nutrientes minerais. Tradicionalmente, o melhoramento genético do cafeeiro foca-se em características morfológicas, resistência a doenças e na produtividade; dessa forma, a exigência nutricional foi deixada em plano secundário ao longo deste processo. Com a necessidade cada vez maior de variedades que apresentem boa produtividade com impactos menores ao meio ambiente, a introgressão de características de genótipos silvestres é uma relevante estratégia para incremento da eficiência nutricional. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo caracterizar a concentração de nutrientes em 12 acessos silvestres de Coffea arabica provenientes da Etiópia, identificando genótipos de cafeeiro que apresentam acumulação diferencial de nutrientes minerais (N, P, K, Ca, Mg, Cu, Zn, B e Mn) com relação a três tecidos: folhas, caule e raiz. Entre os acessos da Etiópia, destacou-se a concentração diferencial de P em folhas do acesso CAF032, e o acúmulo em raiz de N (CAF009), Zn (CAF131) e Mn (CAF023). Bourbon teve acúmulo diferencialmente menor de P no caule e maior de Ca na raiz e Catuaí Vermelho apresentou concentração diferencial de Mg no caule. O presente trabalho é uma importante contribuição na definição de genótipos silvestres de Coffea arabica com potencial de introgressão de características relacionadas à eficiência nutricional.Item ANÁLISE IN SILICO DE GENES ENVOLVIDOS NO TRANSPORTE DE NITRATO, AMÔNIO E URÉIA EM CAFEEIRO(2009) Meda, Anderson Rotter; Pereira, Luiz Felipe Protasio; Santos, Tiago Benedito dos; Caramori, Paulo; Pavan, Marcos Antonio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Embrapa - CaféO nitrogênio (N) é o nutriente mais requerido pelo cafeeiro, sendo adquirido principalmente pelas raízes. As formas de N mais abundantes em solos agrícolas são nitrato (NO 3 -) e amônio (NH 4 +), enquanto que a uréia [CO(NH) 2 ] é a principal forma de N utilizada na adubação do cafeeiro. Devido a participação significativa da adubação nitrogenada nos custos de produção do café, é de interesse a identificação de genes envolvidos na absorção radicular e translocação de nitrogênio no cafeeiro, visando uma otimização da eficiência do uso do nitrogênio pela cultura. Neste trabalho foram encontradas etiquetas de sequências expressas (ESTs) no banco de dados do Projeto Genoma Café relacionadas ao transporte das formas mais relevantes na aquisição do N. O número de contigs/singlets para as diferentes famílias de transportadores decresceu na ordem: nitrato (NRT) > amônio (AMT) > uréia (DUR3). A maior expressão e diversidade de transportadores de nitrato refletem a importância desta forma de N na nutrição e fisiologia do cafeeiro, assim como na maioria das outras espécies de plantas.