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Host transcriptional responses to vascular and foliar phytopathogenic fungi.
(Universidade Federal de Viçosa, 2009) Almeida, Robson Ferreira de; Sakiyama, Ney Sussumu; Universidade Federal de Viçosa
O presente trabalho estudou mecanismos genéticos que controlam a resposta de plantas à uma espécie fitopatogênica do gênero Verticillium. V. dahliae (Vd) e V. longisoporum (Vl) são fungos de solo causadores de doenças vasculares de plantas herbáceas e plantas arbóreas, estas duas espécies são responsáveis por perdas anuais que somam bilhões de dólares. Este patógneo perde um alto grau de sua especificidade quanto ao hospedeiro e viabiliza a colonização e multiplicação em diferentes espécies de plantas. Até o presente momento, pouco se sabe a respeito da base genética e molecular da resistência/tolerância à Verticillium spp. Para preenchimento dessa lacuna, estudou-se a interação entre Vl e a planta modelo Arabidopsis thaliana. Experimentos de microarranjo e análises de metabólitos indicaram que isolados de Vl foram capazes de reprogramar a via metabólica do triptofano, resultando na redução do acúmulo do composto de defesa derivado do triptofano, glucosinolato indólico (IGS). Propõe-se com este estudo uma estratégia de patogenicidade utilizada por Vl que envolve o recrutamento do fator transcricional WRKY 70 como um regulador negativo da biosíntese de de IG. Esta parte do trabalho foi desenvolvida no laboratório da Dra. Paola Veronese da Universidade Estadual da Carolina do Norte (NCSU). Uma outra parte foi o estudo de genes envolvidos na resistência de café à ferrugem causada pelo fungo Hemileia vastatrix . Esta parte do trabalho foi desenvolvida no Biocafé/Bioagro/UFV (Universidade Federal de Viçosa). A metodologia utilizada para isolamento dos genes envolvidos na resistência à ferrugem foi a hibridização subtrativa supressiva (SSH), que se baseia na amplificação preferencial de seqüências diferencialmente, representadas em duas populações de cDNA, possibilitada pela reação em cadeia da polimeras (PCR), e a prevenção da amplificação de sequências comuns pelo evento de supressão possibilitada. Foi utilizado neste trabalho o genótipo Híbrido de Timor CIFC 832/2 . Folhas deste genótipo foram inoculadas com uredóporos de Hemileia vastatrix (raça II). Após a inoculação, o RNA foi extraído das folhas 12 e 24 horas após a inoculação para proceder a hibridização subtrativa supressiva. Foi estudada a expressão de dois genes (cisteína protease e quitinase) através do RT-PCR quantitativo (real time-Polymerase chain reaction) em dois genótipos diferentes, CIFC 832/2 (resistente à H. vastatrix) e Catuaí (susceptível à H. vastatrix). O resultado obtido mostra dois padrões de expressão diferentes para os dois genes nos dois genótipos. A expressão dos dois genes no Híbrido de Timor CIFIC 832/2 foi mais elevada e antecipada quando comparada a expressão observada no Catuaí IAC 44.
IDENTIFICAÇÃO DE GENES DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS DURANTE A INTERAÇÃO INCOMPATÍVEL CAFEEIRO-Hemileia vastatrix
(2009) Gallina, Ana Paula; Almeida, Robson Ferreira de; Caixeta, Eveline Teixeira; Zambolim, Eunize Maciel; Freitas, Fernanda de Souza; Zambolim, Laércio; Sakiyama, Ney Sussumu; Embrapa - Café
O trabalho teve como objetivo identificar genes envolvidos na resistência do cafeeiro contra Hemileia vastatrix, por meio da técnica de Hibridização Subtrativa por Supressão. Para isso, folhas do genótipo Híbrido de Timor CIFC 832/2 foram inoculadas com a raça II do fungo. Esse cafeeiro foi escolhido por ser resistente a todas as raças do patógeno identificadas até o momento. Nos períodos de 12 e 24 horas após a inoculação, os RNAs de folhas inoculadas e não inoculadas foram coletados e os cDNAs sintetizados. A subtração dos cDNAs resultou em quatro bibliotecas contendo 528 clones. Esses clones correspondem a potenciais genes diferencialmente expressos em respostas à infecção do cafeeiro a H. vastatrix. As subtrações foram realizadas em ambas as direções, de forma a possibilitar a identificação de genes induzidos e reprimidos na interação incompatível. A análise da seqüência de 31 clones diferencialmente expressos indicou que muitos destes codificam proteínas envolvidas com a resposta de defesa de hospedeiro a fitopatógenos, como por exemplo, quitinases, proteases serina e endoxyloglucano transferase. A caracterização futura de outros clones das bibliotecas, bem como a comprovação do envolvimento dos genes por outras técnicas de genômica funcional contribuirão para o esclarecimento do mecanismo molecular envolvidos na defesa do cafeeiro a H. vastatrix, visando dar subsídios à obtenção de variedades com resistência duradoura.
Marcadores microssatélites para o cafeeiro
(2005) Rufino, Raphael José Nascif; Caixeta, Eveline Teixeira; Zambolim, Eunize Maciel; Pena, Guilherme Ferreira; Almeida, Robson Ferreira de; Alvarenga, Samuel Mazzinghy; Zambolim, Laércio; Sakiyama, Ney Sussumu; Embrapa - Café
O presente trabalho foi realizado com o objetivo de testar e adaptar marcadores microssatélites para serem rotineiramente utilizados nos trabalhos de genética e melhoramento do cafeeiro. Para isso, foram ajustadas as condições de amplificação de 24 primers microssatélites de café, disponibilizados na literatura. Estes primers, desenvolvidos para Coffea arabica, foram também testados em outras espécies de cafeeiro de importância para o melhoramento visando verificar sua utilidade como primer heterólogo. A adaptação das condições de reação e de amplificação permitiu o uso de 18 primers, sendo que a maioria deles amplificou as três espécies analisadas. O nível de polimorfismo desses microssatélites foi investigado pela amplificação de 60 genótipos, incluindo C. arabica, C. canephora, C. eugenioides e Híbrido de Timor (HT). Observou-se um alto polimorfismo e uma variação de 2 a 9 alelos por marcador. Metade dos primers testados apresentou polimorfismo em C. canephora e 33,3% deles foram polimórficos entre os HT. Foi possível discriminar todos os acessos de C. canephora analisados. Os HT, em geral, apresentaram padrão de bandas semelhante ao dos C. arabica, sendo que seis primers apresentaram polimorfismo, possibilitando a discriminação de 13 acessos, não diferenciados em estudos anteriores com marcadores RAPD. Os resultados demonstraram o potencial dos microssatélites para diferenciar indivíduos geneticamente próximos. Em trabalhos futuros, pretende-se desenvolver novos microssatélites a partir das ESTs do Genoma/Café. Esses novos marcadores, juntamente com os primers adaptados neste trabalho, constituirão em uma importante ferramenta para os estudos genéticos do café no Brasil.
Método de inoculação de Hemileia vastarix Berk. et Br. em folhas destacadas de cafeeiro
(2005) Capucho, Alexandre Sandri; Rufino, Raphael José Nascif; Zambolim, Eunize Maciel; Caixeta, Eveline Teixeira; Oliveira, Antonio Carlos Baião de; Almeida, Robson Ferreira de; Brito, Giovani Greigh de; Zambolim, Laércio; Embrapa - Café
Os estudos genéticos do cafeeiro e de Hemileia vastatrix são muitas vezes dificultados pela característica do fungo de multiplicar apenas nos tecidos da planta hospedeira. Assim, esse trabalho foi proposto com o objetivo de desenvolver um método de inoculação de H. vastatrix que permita estudar com segurança raças e a herança da resistência do cafeeiro à ferrugem. Para isso, utilizou-se a raça II de H. vastatrix, C. arabica ‘Catuaí’ como hospedeiro susceptível e a população segregante de cafeeiro UFV 2148-57 x H511-1. As inoculações foram feitas pela aplicação de 20 gotas de 5 [micra]l de uredosporos na face inferior de folhas destacadas, no interior de gerbox. Após incubação e limpeza da face inferior da folha inoculada os gerbox foram transferidos para câmara com ambiente controlado. Foram feitas quatro avaliações, iniciadas aos 30 dias após a inoculação, com intervalo semanal. O método permitiu detectar genótipos resistentes e susceptíveis no material analisado, sendo que o controle ‘Catuaí’ apresentou grau de susceptibilidade máxima. O método não apresentou escape e permitiu analisar um grande número de genótipos com uma pequena quantidade de uredosporos. Possui ainda as vantagens de praticidade operacional, mão-de-obra e tempo reduzidos, menor gasto de tecido vegetal e redução da contaminação.
Padrão de herança de fonte de resistência do cafeeiro à ferrugem (Hemileia vastatrix Berk. & Br.)
(2005) Brito, Giovani Greigh de; Almeida, Robson Ferreira de; Caixeta, Eveline Teixeira; Loureiro, Marcelo Ehlers; Zambolim, Eunize Maciel; Zambolim, Laércio; Pereira, Antônio Alves; Embrapa - Café
Objetivou-se a descrição da resistência à raça II da ferrugem alaranjada do cafeeiro, raça predominante no Brasil. Para o estudo, o Híbrido de Timor UFV 427-15, genitor resistente, foi cruzado com o genótipo suscetível Catuaí amarelo UFV 2143-236. A planta F1 foi retrocruzada com o Catuaí UFV 2143-236, obtendo-se 135 plantas resultantes do retrocruzamento suscetível (RC1s). Adicionalmente, a população segregante F2 foi obtida através da autofecundação controlada da planta F1. Os genitores, a planta F1, as 135 plantas do RC1s e as 177 plantas da F2 foram inoculadas com uredósporos da raça II, na concentração de 2,0 mg.ml-1. As populações inoculadas foram mantidas sob condições controladas durante 49 dias, período de avaliação. Infere-se, com base nos resultados obtidos que o Híbrido de Timor UFV 427-15 apresentou-se completamente resistente à raça II da ferrugem, isento de quaisquer sintomas de suscetibilidade à doença. Resultado semelhante obteve-se ao analisar as plantas F1 , submetidas aos mesmos procedimentos. De outro modo, as plantas de Catuaí amarelo UFV 2143-236 apresentaram-se suscetíveis, com manchas cloróticas pronunciadas e esporulação abundante. A população de retrocruzamento suscetível apresentou 63 plantas resistentes e 72 suscetíveis. Considerando os resultados obtidos pelo teste de Qui-quadrado, evidencia-se que a proporção fenotípica que melhor explicou a distribuição das freqüências observadas foi a de uma planta resistente para uma suscetível, indicando que a resistência é monogênica dominante. Quanto a população F2,, observou-se a ocorrência de 134 plantas resistentes e 43 suscetíveis e, através do teste de Qui-quadrado, a melhor proporção fenotípica a explicar a distribuição de freqüências observadas foi a de três plantas resistentes para uma suscetível. A análise genética da segregação confirmou a herança monogênica dominante do gene da resistência à raça de ferrugem em questão.