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Análise de expressão gênica de membros da família Saur durante a embriogênese somática de Coffea arabica
(Universidade Federal de Lavras, 2017-04-17) Zanin, Fabiana Couto; Diniz, Leandro Eugenio Cardamone
Tendo em vista a importância do processo de embriogênese somática para a obtenção em larga escala de embriões produtivos selecionados e para pesquisas de melhoramento genético, o presente trabalho objetivou-se por caracterizar os genes SAUR em Coffea canephora e analisar a expressão gênica de alguns membros da família durante a embriogênese somática, além de especular suas possíveis funções. A análise in silico da família gênica foi realizada a partir da comparação de proteínas SAUR já caracterizadas em outras espécies com sequências de café distribuídas no banco de dados Coffee Genome Hub, que passaram por análise de redundância e presença do domínio conservado característico dos genes. Foi construída uma biblioteca de transcritos de C. arabica a partir de amostras de cDNA de calos não embriogênicos (CNE), calos embriogênicos (CE) e suspensões celulares (ECS) sequenciadas, onde foram identificados genes SAUR diferencialmente expressos. O perfil de expressão foi então analisado por RT-qPCR em amostras de C. arabica. Em C. canephora foram encontrados 31 membros da família SAUR, destes, 8 encontraram-se diferencialmente expressos nas bibliotecas sequenciadas e o perfil dos genes SAUR5, 12, 13, 18 e 20 foram analisados in vivo no presente trabalho. Ainda são necessários estudos mais aprofundados para determinar as funções de cada um dos genes analisados durante a embriogênese somática, mas os resultados obtidos parecem estar de acordo com outros estudos de que os genes SAUR são induzidos por auxina e estão, em grande parte, envolvidos com expansão e elongação celular.
Construção de uma biblioteca genômica de cromossomo artificial de bactéria de Coffea arabica
(2007) Cação, Sandra Maria Bellodi; Diniz, Leandro Eugenio Cardamone; Silva, Nathalia V.; Veniky, Filipe; Andrade, Alan Carvalho; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Embrapa - Café
A produção de mapas físicos em plantas tem grande importância para estudos de genética e melhoramento. O passo inicial para produção destes mapas é a construção de bibliotecas genômicas com largos fragmentos de DNA, em vetores do tipo cromossomo artificial de bactéria (BAC) ou de levedura (YAC). Visando a produção de um mapa físico, o objetivo deste trabalho foi construir uma biblioteca genômica de BAC de café. Fragmentos de DNA de alto peso molecular de C. arabica híbrido de Timor cv. 832/2 foram clonados no vetor pCC1BAC e transformados em E. coli DH10B. Após transformação 57000 clones foram inicialmente obtidos e ordenados manualmente em placas de 96 poços. A biblioteca foi transferida em triplicata para placas de 384 poços, com equipamento Q-BOT, resultando em 55.778 clones em 148 placas. A verificação do tamanho do inserto de 130 clones revelou tamanho médio de 115-120 Kb. A cobertura do genoma haplóide estimada para C.arabica foi de cinco vezes. A validação da biblioteca presença de DNA de cloroplasto e mitocôndria, assim como a seleção inicial com sondas para iniciar o mapeamento físico, está sendo realizada através de hibridização de colônias em membranas contendo 18.462 clones em duplicata.
Embriogênese somática e validação do sistema CRISPR/CAS9 em Coffea canephora
(Universidade Federal de Lavras, 2020-05-11) Casarin, Tatiane; Diniz, Leandro Eugenio Cardamone; Paiva, Luciano Vilela
Coffea canephora é a segunda espécie mais cultivada do gênero Coffea, representando cerca de 25% da produção brasileira e sendo especialmente utilizada na indústria do café solúvel e em blends com Coffea arabica. A espécie apresenta alta variabilidade genética, tendo os programas de melhoramento buscado a identificação, seleção e propagação de genótipos com características superiores. Entretanto o melhoramento convencional demanda muito tempo e a aplicação de ferramentas biotecnológicas pode ajudar a acelerar este processo. Dessa forma, os objetivos deste trabalho foram testar diferentes protocolos de indução de embriogênese somática (ES) direta para C. canephora visando a sua aplicação em trabalhos futuros de transformação genética, a validação da aplicação de uma estratégia multiplex do sistema CRISPR/Cas9 através do silenciamento do gene CcPDS, e a obtenção de plantas com redução do teor de cafeína através do silenciamento, via CRISPR/Cas9, dos genes das enzimas de biossíntese da cafeína: xantosina metiltransferase (XMT), 7-metilxantina metiltransferase (MXMT) e 3,7-dimetilxantina metiltransferase (DXMT). Para a avaliação da indução de ES direta foram utilizados explantes provenientes de folhas de plântulas in vitro e de folhas de plantas de casa de vegetação de C. canephora clone 22, submetidos a três diferentes tratamentos de indução. O mais eficiente para indução de ES direta foi o Meio 3, com 96,25% de eficiência de indução e média de 34 embriões por explante de folhas in vitro e 67% de eficiência de indução e média de 67 embriões por explante de casa de vegetação. Em ambos experimentos de edição genômica, foram utilizados calos embriogênicos de C. canephora clone 14 e diferentes construções gênicas multiplex, nas quais os sgRNAs estavam sob a regulação de promotores U6 de C. canephora ou Arabidopisis thaliana. Plântulas e embriões apresentando os fenótipos albino, variegado e verde foram obtidas na transformação com as construções contendo sgRNAs para o gene CcPDS, sendo que 71,4% das plantas avaliadas apresentaram algum tipo de mutação, a maioria em homozigose. Seis plantas possivelmente transformadas para o silenciamento dos genes de síntese de cafeína foram analisadas e cinco estavam efetivamente transformadas. Destas, apenas uma apresentou mutações nas regiões reconhecidas pelos sgRNAs, sendo uma mutação em heterozigose no segundo alvo do gene XMT, uma mutação também em heterozigose nos dois alvos do gene DXMT e nenhuma mutação observada no gene MXMT. Com os resultados obtidos, é possível concluir que a ES direta é uma estratégia muito mais rápida de regeneração de embriões de cafeeiro e o genótipo parece ter forte influência no sucesso de estratégias de silenciamento gênico em C. canephora, assim como os genes a serem silenciados, que podem afetar o desenvolvimento das plantas editadas.
Expression of the CcDREB1D promoter in coffea arabica: functional genomics and transcriptome analysis
(Universidade Federal de Lavras, 2017-04-20) Torres, Luana Ferreira; Diniz, Leandro Eugenio Cardamone
A mudança climática está colocando um grande desafio para a produção mundial de café e uma das estratégias para superar esses problemas consiste na geração de culturas com maior tolerância à seca e outros estresses abióticos, através de abordagens biotecnológicas e avançadas técnicas de melhoramento molecular. Ao longo de sua evolução, as plantas desenvolveram uma série de mecanismos de tolerância ao estresse abiótico. No entanto, a ativação desses mecanismos varia dependendo da espécie da planta, que determina o seu nível de tolerância ao estresse. A elucidação da função dos genes de tolerância ao estresse e também do processo de defesa vegetal nestas condições é de fundamental importância para a obtenção de variedades agrícolas mais resistentes, o que consequentemente pode contribuir para a redução de perdas nas culturas em condições climáticas adversas. Estudos recentes resultaram na identificação de muitos genes candidatos em Coffea para tolerância à seca apresentando perfis de expressão diferencial contrastantes entre genótipos. Entre estes genes, os DREBs estão envolvidos na via de resposta ao estresse hídrico como os fatores de transcrição vegetais que regulam a expressão de muitos genes induzíveis por estresse e desempenham um papel crítico na melhoria da tolerância ao estresse abiótico das plantas através da interação com um cis –elemento (DRE/CRT) presente na região promotora de vários genes responsivos ao estresse abiótico. Entre outros DREBs, o gene CcDREB1D mostrou um aumento nos níveis de mRNA durante a aclimatação por estresse de seca. Isto indica uma regulação distinta para a expressão de genes homólogos nos dois genótipos e sugere que este gene pode contribuir para a diversidade observada entre genótipos. Atualmente, as estratégias de sequenciamento de alto desempenho do transcriptoma (RNA-Seq) permitem gerar um grande volume de dados, a baixo custo e em um curto período de tempo. Esta informação permite a realização de estudos de perfis transcripcionais e redes genéticas numa compreensão aprofundada de vários perfis de genes. Diante deste contexto, o capítulo 1 apresenta uma revisão de literatura englobando desde as características de origem e comerciais do café até o estudo de genes e seu transcriptoma. O Capítulo 2 compreendeu o estudo de três haplótipos do promotor CcDREB1D isolados de clones tolerantes e sensíveis à seca de C. canephora avaliando a capacidade do promotor para controlar a expressão do gene repórter uidA em resposta ao déficit hídrico. O Capítulo 3 compreendeu o estudo do haplótipo pHP16L isolado de C. canephora e sua participação na expressão do gene repórter uidA em resposta aos estresses de seca, altas e baixas temperaturas, alta intensidade luminosa e aplicação exógena de ABA, acompanhados de dados de RT-qPCR. O capítulo 4 compreendeu analisar as condições de expressão do haplótipo pHP16L do promotor DREB1D sob uma faixa representativa dos estresses abióticos mais comuns, utilizando a técnica de RNA-seq como ferramenta para entender o mecanismo de tolerância ao estresse das plantas e a expressão dos genes estresse induzido bem como dos genes DREBs, acompanhados de validação dos dados pela técnica RT-qPCR.
Isolamento de um cDNA de catalase de café
(2005) Diniz, Leandro Eugenio Cardamone; Sakiyama, Ney Sussumu; Noir, Sandra; Fernandez, Diana; Lashermes, Philippe; Embrapa - Café
Uma biblioteca de cDNA de "Caturra" foi utilizada para se isolar fragmentos de genes associados à resistência, através da hibridização com sondas RGA. Após a utilização das nove famílias RGA de café, 32 colônias foram isoladas e seqüenciadas. Destas, 25 seqüências não apresentaram similaridade com outras seqüências disponíveis na base de dados do NCBI ou não puderam ser seqüenciadas. Seis amostras continham seqüências muito pequenas e não confiáveis, e apenas uma amostra resultou em uma seqüência de 428 nucleotídeos (142 aminoácidos). Esta seqüência apresentou alta homologia a catalases de outras plantas como Nicotiana plumbaginifolia, Glycine max, Phaseolus vulgaris, entre outras. A esta catalase descoberta em café foi dado o nome de Cat-C. A catalase de ligação ao ácido salicílico (SR1) e a seqüência parcial de aminoácidos da proteína de ligação ao ácido salicílico (SABP), ambos de N. tabacum, apresentaram 82% e 77% de identidade, respectivamente, quando comparadas a Cat-C. Na região C-terminal desta catalase foi detectada a presença de uma seqüência peroxissomal. No entanto, ao invés de uma seqüência SRL (Serina-Arginina-Leucina), foi encontrada uma seqüência TRL (Treonina-Arginina-Leucina). Esta diferença é devido à troca de uma timina por uma adenina. Estes dados sugerem que Cat-C pode estar associado ao mecanismo de resistência em café.
Mapeamento físico da região cromossômica próxima ao gene de resistência a Meloidogyne exigua (Mex-1) em Coffea arabica L.
(Universidade Federal de Viçosa, 2004) Diniz, Leandro Eugenio Cardamone; Sakiyama, Ney Sussumu; Universidade Federal de Viçosa
O nematóide de galhas, Meloidogyne exigua, parasita o cafeeiro (Coffea sp.) e sua erradicação das regiões infestadas é impraticável. Estudos anteriores mostraram que a resistência a M. exigua é controlada por um gene de herança simples, designado Mex-1, presente em C. canephora. Linhagens de café arábica apresentando resistência têm sido desenvolvidas em programas de melhoramento genético por meio da introgressão deste gene. Uma biblioteca BAC de café foi avaliada inicialmente utilizando-se três marcadores (Exi-2, Exi-3 e Exi-4) ligados a Mex-1, obtidos a partir de marcadores AFLP previamente clonados. Os clones positivos associados à região Mex-1 foram identificados e isolados. O DNA destes clones foi então analisado por hibridização e amplificação com marcadores SCAR (Exi-2 e Exi-3) e 9 combinações de primers das extremidades BAC. Os clones BAC positivos, relativos aos marcadores Exi-2, Exi-3 e Exi-4, foram reunidos em 5 contigs. O primeiro contig apareceu composto de dois clones BAC identificados com o marcador Exi-4. Dos cinco clones BAC identificados com o marcador Exi-2, dois contigs designados Exi-2 I e Exi-2 II foram distintos. Os clones BAC Exi-3 foram organizados em dois contigs distintos chamados Exi-3 I e Exi-3 II. No total, nove sítios de restrição ou de PCR, correspondendo a sete marcadores físicos, foram localizados na região Exi-3. As três regiões cromossômicas correspondentes ao contig Exi-4, aos dois contigs Exi-2 e aos dois contigs Exi-3 não apresentaram sobreposição. A presença de clones BAC contendo análogos de gene de resistência (RGA) na região Mex-1 foi investigado por meio de amplificação com primers degenerados e hibridização com sondas RGA de café. Alguns clones BAC contendo RGAs foram identificados. Para confirmar a introgressão do gene Mex-1, vinte e uma linhagens de Icatu foram comparadas a três testemunhas resistentes, "Iapar 59", "Híbrido de Timor" e "Sarchimor" e a uma testemunha susceptível, "Catuaí". Foi avaliada, por meio de marcadores AFLP, a presença do fragmento introgredido associado ao locus Mex-1. Nove marcadores AFLP foram amplificados. Destes, os marcadores Exi-1, Exi-2, Exi-3, Exi-11 e Exi-13 confirmaram a presença do fragmento associado à resistência a M. exigua, mostrando que esta marca pode ser utilizada em programas de seleção assistida. Uma biblioteca de cDNA de "Caturra" foi utilizada para se isolar fragmentos de genes associados à resistência, através da hibridização com sondas RGA. Após a utilização das nove famílias RGA de café, 32 colônias foram isoladas e seqüenciadas. Destas, 25 seqüências não apresentaram similaridade com outras seqüências disponíveis na base de dados do NCBI ou não puderam ser seqüenciadas. Seis amostras continham seqüências muito pequenas e não confiáveis, e apenas uma amostra resultou em uma sequência de 428 nucleotídeos (142 aminoácidos). Esta seqüência apresentou alta homologia a catalases de outras plantas como Nicotiana plumbaginifolia, Glycine max, Phaseolus vulgaris, entre outras. A esta catalase descoberta em café foi dado o nome de Cat-C. A catalase de ligação ao ácido salicílico (SR1) e a seqüência parcial de aminoácidos da proteína de ligação ao ácido salicílico (SABP), ambos de N. tabacum, apresentaram 82% e 77% de identidade, respectivamente, quando comparadas a Cat-C. Na região C-terminal desta catalase foi detectada a presença de uma seqüência peroxissomal. No entanto, ao invés de uma seqüência SRL (Serina-Arginina-Leucina), foi encontrada uma seqüência TRL (Treonina-Arginina-Leucina). Esta diferença é devido à troca de uma timina por uma adenina. Estes dados sugerem que Cat-C pode estar associado ao mecanismo de resistência em café.
Mapeamento físico detalhado do loco Mex-1 com clones BAC em café
(2003) Diniz, Leandro Eugenio Cardamone; Noir, Sandra; Combes, Marie-Christine; Sakiyama, Ney Sussumu; Lashermes, Philippe; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
O nematóide da espécie Meloidogyne exigua parasita o café (Coffea arabica L.) e sua erradicação das regiões infestadas é impraticável. Estudos anteriores mostraram que a resistência a M. exigua é controlado por um gene de herança simples, designado Mex-1 presente na espécie C. canephora. Linhagens de café arábica apresentando resistência têm sido desenvolvidas em alguns programas de melhoramento por meio da introgressão deste gene. O estudo da forma de introgressão do gene Mex-1 de C. canephora em C. arabica, pode dar a oportunidade de melhor entendimento da genética da resistência. Muitos estudos têm demonstrado que bibliotecas BAC são bem apropriadas para a clonagem baseada em mapa e para o mapeamento físico. O desenvolvimento desta biblioteca (BAC) permite acelerar o mapeamento do gene Mex-1. A biblioteca BAC de café foi avaliada com 3 marcadores ligados a Mex-1, obtidas a partir de marcadores AFLP clonados. A partir destes marcadores, Exi-2, Exi-3 e Exi-4, foram identificados 5, 11 e 2 clones positivos, respectivamente. Os 18 clones positivos associados à região Mex-1 foram identificados e isolados. Estes marcadores moleculares flanqueando Mex-1 foram reunidos em 3 regiões de contig. O tamanho dos insertos variou entre 130 e 250 kb. Os clones BAC Exi-2 e Exi-3 foram, respectivamente, separados em 2 contigs homeólogos. Isto é consistente com a estrutura alotetraplóide de C. arabica. Cada contig homeólogo está contido em um dos 2 subgenomas de C. arabica. Além disso, a distinção de apenas 2 contigs homeólogos sugere que o fragmento introgredido levando Mex-1 é o resultado de uma recombinação homóloga entre os genomas de C. canephora e um dos dois subgenomas de C. arabica. Estes clones BAC foram analisados por fingerprinting e seus padrões de bandas foram comparados. O DNA dos clones foi então analisado por hibridação e amplificação com SCAR (Exi-2 e Exi-3) e 9 combinações de primers das extremidades BAC (3A-T7, 3B-T7, 3B-SP6, 3G-T7, 3H-T7, 3K-T7, 4A-T7, 4A-SP6 e 4B-T7) foram também utilizados. Os clones BAC positivos, relativos aos marcadores Exi-2, Exi-3 e Exi-4, foram reunidos em 5 contigs. O primeiro contig aparece composto de dois clones BAC positivos com o marcador Exi-4. O padrão de fingerprinting destes clones mostrou forte semelhança, apresentando também o mesmo perfil RFLP com a sonda 4B-T7. Dos cinco clones BAC identificados com o marcador Exi-2, dois contigs designados Exi-2 I e Exi-2 II foram distintos. O primeiro consiste nos BAC 2B e 2E, enquanto o segundo dos BAC 2A, 2C e 2D. Os clones BAC positivos Exi-3 estão organizados em dois contigs distintos chamados Exi-3 I e Exi-3 II. No total, nove sítios de restrição ou PCR, correspondentes a sete marcadores físicos (seqüências identificadas por hibridação ou PCR) foram localizados na região Exi-3. Baseado nos seis marcadores físicos compartilhados pelos dois contigs, foi observada uma certa colinearidade nestes contigs. Não havia nenhuma diferença discernível na posição dos marcadores entre os dois contigs Exi-3. Apesar disso, os dois contigs homeólogos mostraram diferenças significativas. As três regiões cromossômicas correspondentes ao contig Exi-4, os dois contigs Exi-2 e os dois contigs Exi-3 não apresentaram nenhuma sobreposição. Como esperado para a estrutura alotetraplóide de C. arabica, contigs homeólogos foram identificados. Além disso, a presença dentro da região Mex-1 de clones BAC contendo genes análogos de resistência (RGAs) foi investigado por amplificação, utilizando para isso, primers degenerados e hibridação com sondas RGA de café. Clones BAC positivos foram identificados para várias famílias de RGA. A região Mex-1 parece formar um complexo agrupamento de genes de resistência.
Progressos no mapa de ligação gênica de Coffea arabica L. obtido com base em marcadores RAPD
(2003) Oliveira, Antonio Carlos Baião de; Sakiyama, Ney Sussumu; Diniz, Leandro Eugenio Cardamone; Zambolim, Laércio; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
O desenvolvimento de mapas de ligação genética é uma das aplicações de maior importância da tecnologia dos marcadores moleculares no melhoramento de plantas, pois estes mapas permitem a geração de informações básicas a respeito da estrutura, organização e evolução do genoma, a localização das regiões genômicas que controlam características de importância agronômica, a quantificação do efeito destas regiões nos caracteres estudados, a decomposição de características complexas nos seus componentes mendelianos e a utilização de todas estas informações nos programas de melhoramento. O desenvolvimento de mapas de ligação saturados possibilita o teste de marcadores distribuídos por todo o genoma, aumentando a chance de se obter associações significativas com características de interesse. No caso de Coffea arabica L. (2n=4X=44), a construção de mapas de ligação tem sido dificultada em razão do baixo polimorfismo e de complicações advindas da poliploidia. Este trabalho se propôs a construir um mapa parcial de ligação gênica para Coffea arabica L., com base em marcadores RAPD, a partir de uma população segregante RC 1 de 59 plantas oriunda do cruzamento entre uma linhagem do Híbrido de Timor CIFC 2570 (UFV 445-46) e o cultivar Catuaí Amarelo IAC 30 (UFV 2143-235), este utilizado como genitor recorrente. Na identificação dos marcadores polimórficos, foram testados 1.200 primers da Operon Technologies (Kits OPA-OPZ, OPAA-OPAZ e OPBA-OPBH) e várias combinações aleatórias de pares de primers. A população segregante (RC 1 ) foi analisada pelos marcadores polimórficos consistentes, em que a banda polimórfica estava presente no genitor não-recorrente (Híbrido de Timor) e no F 1 e ausente no genitor recorrente (Catuaí). Os marcadores obtidos foram analisados pelo aplicativo GQMOL, utilizando, na construção do mapa, os marcadores que segregaram na proporção esperada de 1:1. Grupos de ligação foram estabelecidos pela análise de dois pontos, considerando-se a freqüência de recombinação máxima de 0,35 e o LOD escore mínimo de 3.0. Análises de três pontos e multipontos foram então utilizadas para encontrar a mais provável ordem dos marcadores dentro dos grupos de ligação e a função de Kosambi foi usada para conversão das taxas de recombinação em distâncias de mapa (cM – centiMorgan). Dos 1.200 primers de RAPD testados para a identificação de marcadores polimórficos entre os genitores e F 1 , 127 (10,6%) produziram fragmentos consistentes, presentes no Híbrido de Timor e no F 1 , mas ausentes no ‘Catuaí Amarelo’. Esses 127 primers informativos deram origem a 165 marcadores RAPD polimórficos (1,3 marcador por primer), dos quais 124 (75,15%) segregaram na proporção esperada de 1:1 e 41 (24,85%) exibiram desvio nesta segregação pelo teste Ç 2 (P>0,05). O nível de polimorfismo revelado pelas combinações de primers foi bem inferior (1,43%), pois das 698 combinações testadas, apenas dez foram polimórficas, em que sete destas apresentaram um único fragmento polimórfico e três, duas bandas polimórficas. Destes 13 marcadores, dez (76,9%) apresentaram segregação esperada de 1:1 e três (23,1%) mostraram desvio nessa proporção. Os 134 marcadores RAPD que segregaram na proporção esperada de 1:1, foram utilizados para a construção do mapa parcial de ligação. Dezessete destes marcadores não se mostraram ligados a nenhum dos grupos de ligação, enquanto os 117 marcadores restantes formaram 11 grupos de ligação, cobrindo 794,3 cM do genoma. O mapa apresentou boa distribuição dos marcadores nos grupos de ligação, nos quais a distância máxima entre dois marcadores foi de 26,93 cM no grupo 11, e apenas sete intervalos entre marcadores apresentaram distâncias acima de 20 cM. O número de grupos de ligação obtido foi bastante inferior ao correspondente número haplóide de cromossomos de Coffea arabica (n=22). Por essa razão, o genoma da espécie foi parcialmente explorado e muitas regiões ainda não foram identificadas. Outros tipos de marcadores moleculares, principalmente AFLP e SSR, devem ser incluídos, para melhorar a cobertura do genoma do cafeeiro, com a formação de novos grupos de ligação, inclusão dos marcadores não ligados e saturação dos intervalos nos grupos obtidos.
O uso de RAPD associado a enzimas de restrição para detectar variabilidade genética no banco de germoplasma de Coffea arabica L. do IAPAR
(2000) Diniz, Leandro Eugenio Cardamone; Ruas, Paulo Maurício; Ruas, Claudete de Fátima; Sera, Tumoru; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
A variabilidade genética existente entre 40 acessos de Coffea arabica foi avaliada utilizando RAPD associado a uma pré-digestão do DNA genômico com endonucleases de restrição. Os acessos analisados fazem parte da coleção de Coffea mantida no Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR). A variabilidade genética e a relação entre os acessos foram analisadas utilizando 184 primers. Entretanto, nenhum polimorfismo ou baixo nível de bandas polimórficas foi observada em cada primer. Para melhorar a eficiência na detecção do polimorfismo, o DNA genômico de todos os acessos foi submetido à digestão com enzimas de restrição antes da amplificação. Treze primers utilizados associados ou não às enzimas de restrição, que sugeriram polimorfismo, foram selecionados. Um dendrograma foi construído utilizando o agrupamento UPGMA. Um total de 236 produtos de amplificação foi obtido, com 216 bandas polimórficas (91,5%). Os resultados mostraram a utilidade das enzimas de restrição para estimar a relação genética dos acessos de C. arabica.