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Análise da expressão do gene manose 6 fosfato redutase em cafeeiros submetidos ao déficit hídrico
(Editora UFLA, 2013-01) Freire, Luciana Pereira; Marraccini, Pierre; Rodrigues, Gustavo Costa; Andrade, Alan Carvalho
Os efeitos do déficit hídrico sobre a expressão do gene CaM6PR, codificando a manose-6-fosfato redutase, foram avaliados em cafeeiros em fase de formação das cultivares IAPAR59 (Villa Sarchi x hibrido de Timor HT832/2) e RUBI MG 1192 (Mundo Novo x Catuaí) de Coffea arabica, consideradas respectivamente como tolerante e sensível ao estresse hídrico. As cultivares foram plantadas em dezembro de 2007 no campo experimental da Embrapa Cerrados – DF (CPAC) e cultivadas durante dois anos (2008 e 2009) com (I) e sem (NI) irrigação. Para cada ano, foram realizadas duas avaliações (P1, não estressado, durante a estação chuvosa e P2, estação seca). Para as duas cultivares, a expressão do gene CaM6PR foi medido em folhas por meio da técnica de PCR quantitativa, apresentou um forte aumento na estação seca para as plantas não irrigadas em comparação com as plantas irrigadas. Além disso, a expressão desse gene sempre foi maior no IAPAR59 que no RUBI MG 1192. Também, observou-se uma maior expressão desse gene no ano de 2008, quando comparada ao ano de 2009. Essa diferença poderia ser uma consequência direta dos níveis de estresse hídrico recebidos pelas plantas, já que as condições da seca em 2008 foram mais severas do que no ano de 2009. Assim,nesse trabalho, propõe-se o uso do gene CaM6PR como marcador molecular, para avaliar o nível de estresse das plantas cafeeiras submetidas ao déficit hídrico.
Análise da variabilidade de sequências no gene DREB1D em diferentes genótipos do gênero Coffea
(Embrapa Café, 2013) Alves, Gabriel Sérgio Costa; Freire, Luciana Pereira; Vieira, Natália Gomes; This, Dominique; Pot, David; Marraccini, Pierre; Paiva, Luciano Vilela; Andrade, Alan Carvalho
Em várias espécies vegetais, os genes DREB desempenham um papel importante na resposta aos estresses abióticos. A obtenção de marcadores de diversidade fenotípica para assistir aos programas de melhoramento genético é prioritário. Neste contexto, o conhecimento da correlação entre polimorfismo genético e o mecanismo de tolerância à seca pode representar um avanço significativo para o melhoramento de plantas cultivadas. Assim, visando estudar a variabilidade genética presente no gene DREB1D e desenvolver marcadores funcionais para alelos efetivos, polimorfismos foram caracterizados e identificados após análises de sequências alélicas isoladas de diferentes genótipos do gênero Coffea. As análises permitiram identificar polimorfismos na região promotora e codante do gene DREB1D de C. canephora (CcDREB1D), nos seus ortólogos e homoeólogos. Os polimorfismos encontrados possibilitaram a identificação de diferentes haplótipos. As variações de sequência ortóloga (OSVs) entre C. canephora e C. eugenioides, assim como, as variações nucleotídicas únicas de homoeólogos (HSVs) entre os subgenomas de C. arabica, C. canephora (CaCc) e C. eugenioides (CaCe) são apresentadas para o desenvolvimento de marcadores alelo-específico e homoeólogo-especifico para este locus.
ANÁLISE DE EXPRESSÃO E POLIMORFISMO NUCLÉICOS DE GENES CANDIDATOS PARA A TOLERÂNCIA À SECA EM CAFEEIRO
(2011) Freire, Luciana Pereira; Vieira, Natália Gomes; Vinecky, Felipe; Alves, Gabriel Sérgio Costa; Heimbeck, Ingrid Gomes Renoldi; Rodrigues, Gustavo Costa; Marraccini, Pierre; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
O presente trabalho teve como objetivos (i) analisar a expressão de genes candidatos (GC), que foram previamente identificados em plantas de Coffea canephora,e agora analisar a expressão em plantas de Coffea arabica cultivadas no campo e submetidas e não submetidas ao estresse hídrico e (ii) avaliar a diversidade genética de alguns GCs por meio da busca dos polimorfismos nucléicos. Os experimentos de expressão gênica foram realizados com os cultivares IAPAR59 (tolerantes à seca) e Rubi (sensível à seca) de C. arabica cultivados com e sem irrigação durante a estação seca. As folhas foram amostradas no ano de 2008 foram utilizadas para analisar a expressão de GCs por PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Em paralelo, seqüências gênicas correspondentes aos GC foram clonadas e seqüenciadas a partir do DNA genômico de diferentes espécies, clones e cultivares de cafeeiro. Os polimorfismos foram identificados e permitiram de definir os haplótipos encontrados nos genótipos estudados.
Analysis of the mannose 6 phosphate reductase gene expression in coffee trees submitted to water deficit
(Editora UFLA, 2013-01) Freire, Luciana Pereira; Marraccini, Pierre Roger; Rodrigues, Gustavo Costa; Andrade, Alan Carvalho
The effects of water deficit on the gene CaM6PR expression, encoding mannose -6- phosphate reductase, were evaluated in coffee trees in the formation phase of coffee cultivars IAPAR59 (Villa Sarchi x Timor hybrid HT832 / 2) and RUBI MG 1192 (Mundo Novo x Catuaí) of Coffea arabica, respectively regarded as tolerant and sensitive to water stress. The cultivars were planted in December 2007 in the experimental field of Embrapa Cerrados - DF (CPAC) and cultured for two years (2008 and 2009) with (I) and without (NI) irrigation. For each year two assessments were carried out (P1 , not stressed, during the rainy season and P2 , dry season). For both cultivars, the CaM6PR gene expression measured in leaves through quantitative PCR, showed a strong increase in the dry season for non-irrigated plants when compared with irrigated plants. In addition, the expression of this gene was always greater in IAPAR59 than in RUBI MG 1192. Also, there was an increased expression of this gene in 2008 when compared to 2009. This difference could be a direct consequence of drought stress levels received by plants, since drought conditions in 2008 were more severe than in 2009. Thus, in this work, we propose the use of the CaM6PR gene as a molecular marker to evaluate the stress level of the coffee plants submitted to water deficit.
DESENVOLVIMENTO DE NOVAS METODOLOGIAS PARA A IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS DURANTE O DESENVOLVIMENTO DE FRUTOS DO CAFÉ (COFFEA ARABICA L.)
(2011) Heimbeck, Ingrid Gomes Renoldi; Taquita, Jorge Alex; Prates, Maura Vianna; Vinecky, Felipe; Alves, Gabriel Sérgio Costa; Vieira, Natália Gomes; Freire, Luciana Pereira; Bloch Junior, Carlos; Marraccini, Pierre; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
O café é uma das bebidas mais consumidas e um dos principais produtos agrícolas,comercializado mundialmente. A espécie Coffea arabica, preferível pelos agricultores, fornece grãos cuja bebida é reconhecida como de melhor qualidade pois constituí-se bioquimicamente de elevadas concentrações de carboidratos, lipídeos e trigonelina. O desenvolvimento e crescimento do fruto são caracterizados pela evolução dos tecidos embrionários e alterações bioquímicas, ilustrando a importância do seu estudo para melhor compreender as características finais dos grãos. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma nova metodologia eficaz na identifcação do conteúdo protéico expresso no endosperma do fruto do café da espécie C. arabica var. IAPAR59 (I59) em diferentes estágios de maturação. A metodologia utilizada neste trabalho baseia-se na estratégia proteômica bottom-up, com digestão protéica, análises por cromatografia líquida em fase reversa e espectrometria de massa com interfaces on-line e off-line. O primeiro permitiu o assinalamento da estrutura primária completa de vinte e sete peptídeos que foram identificados por alinhamento semântico local (BLAST) e apresentaram homologia com quatro proteínas com função ainda desconhecida e nove proteínas com funções já descritas, dentre elas a globulina 11S e a dehydrina, envolvida na proteção osmótica das células vegetais. A interface on-line permitiu o assinalamento da estrutura primária de trinta e quatro peptídeos, dos quais treze deles correspondiam a proteínas com funções ainda desconhecidas, quatro com sequências ainda não descritas e quatorze proteínas com funções conhecidas expressas nos diferentes estágios de desenvolvimento. Diante do exposto, as técnicas utilizadas neste trabalho abrem boas perspectivas para uma melhor compreenção das alterações proteômicas que ocorrem durante os diferentes estágios de desenvolvimento e maturação dos grãos cafeeiros. Entretanto, ajustes metodológicos ainda se fazem necessários para permitir a identificação de um número maior de proteínas, especialmente aquelas em menor abundância.
Estudo da expressão e análise de polimorfismos de genes candidatos para a tolerância à seca em cafeeiro
(Universidade Federal de Lavras, 2010-08-31) Freire, Luciana Pereira; Marraccini, Pierre Roger René
O cafeeiro é uma planta perene, pertencente à família Rubiaceae e ao gênero Coffea. Entre as espécies cultivadas, Coffea canephora (Robusta) e Coffea arabica (Arabica) são as mais importantes economicamente, representando respectivamente 30% e 70% da produção comercial mundial. O déficit hídrico afeta a cultura do cafeeiro podendo resultar em importantes conseqüências sociais (deslocamento de trabalhadores), econômicas e ecológicas. Estudos na área de melhoramento do café têm visado à introdução de novos caracteres para a obtenção de híbridos mais tolerantes à seca. Em nível molecular, existem projetos para se identificar genes candidatos (GC) para a tolerância à seca, seja por meio de estudos da expressão gênica (transcriptoma) ou de proteínas (proteômica). Assim, o primeiro objetivo desse trabalho consistiu em estudar a expressão de GCs (DREB, NAC-R26, RD29, GC10, CCoAMT, OEC, CA, M6FR, as isoformas RBCS1-A e B do gene RBCS), utilizando-se vários cultivares de C. arabica cultivados em campo sob situações diversas de estresse hídrico, por meio da técnica de PCR em tempo real (qPCR). Os GCs utilizados foram previamente identificados e validados, em experimentos com cultivares de C. canephora cultivados em casa de vegetação. O segundo objetivo consistiu em analisar a diversidade nucleotídica in vivo de alguns GCs (DREB, RD29 e NAC-RD26), identificando-se SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), em várias espécies, clones e cultivares de café para tentar relacionar a ocorrência de SNPs com o fenótipo. Para a busca de SNPs , DNA genômico (gDNA) dessas diferentes plantas foram amplificados com dois primers específicos para cada GC utilizado. Os primeiros primers contêm nas extremidades adaptadores M13For ou M13Rev, os quais permitiram avaliar a presença de SNPs, por meio do seqüenciamento dos produtos de PCR sem a clonagem. Para se identificar as formas alélicas presentes em cada genoma, primers (sem adaptadores) foram usados para se amplificar, clonar e seqüenciar as mesmas porções de gDNA. Para o sequenciamento, foram utilizados 10 clones independentes, visando-se a identificação do máximo possível de alelos. As seqüências resultantes foram alinhadas, pelo emprego de aplicativos computacionais visando-se a identificação de regiões polimórficas.
IDENTIFICAÇÃO DE GENES COM EXPRESSÃO DIFERENCIAL EM FOLHAS DE CAFEEIRO Coffea canephora E Coffea arabica SUBMETIDAS À DIFERENTES CONDIÇÕES DE ESTRESSE HÍDRICO
(2009) Marraccini, Pierre; Alves, Gabriel Sergio Costa; Vinecky, Felipe; Freire, Luciana Pereira; Vieira, Natalia Gomes; Ramos, Humberto J. O.; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Elbelt, Sonia; Marques, Thomas; Rodrigues, Gustavo Costa; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
Com a perspectiva de se estabelecer um programa de melhoramento genético por seleção assistida para a tolerância à seca em cafeeiro, o presente trabalho objetivou a identificação de genes candidatos para esta característica, por meio de análises integradas dos perfis de expressão gênica e protéico. Os resultados foram obtidos a partir de análises comparativas da expressão gênica e protéica de diferentes materiais genéticos (Tolerante vs. Sensível) assim como, diferentes regimes hídricos (Controle vs. Estresse hídrico). Os materiais genéticos estudados neste trabalho foram os clones de conillon 22 e 14 (Coffea canephora) e os cultivares Rubi e Iapar 59 (Coffea arabica). O estresse hídrico (Ψ PD =-3,0 MPa) aplicado às plantas de conillon foi obtido em casa de vegetação e no caso de Arabica, foram avaliadas plantas adultas em condições de campo, sendo as folhas colhidas nos períodos diurno e noturno, onde o maior estresse hídrico observado foi de Ψ PD =-1,7 MPa. Após a seleção dos genes candidatos por meio de diferentes estratégias, a expressão diferencial foi validada por qPCR. Os resultados mostram que muitos genes apresentaram uma queda de expressão com o estresse hídrico e esses genes, em geral, codificam proteínas implicadas na fotossíntese. Por outro lado, o estresse hídrico em cafeeiro, também induz a expressão de vários genes já descritos na literatura como essênciais à resposta das plantas à limitação de água, tais como RD29, DREBA e NAC, por exemplo. Já no caso de um gene que codifica para uma dehidrina, os resultados obtidos neste trabalho, permitiram confirmar as expressões diferenciais previamente observadas em C. canephora, também em C. arabica. Contudo, este estudo revelou a importância de outros fatores no controle da expressão desses genes, tais como os ritmos circadianos (ciclos noite/dia), a idade e o “histórico” das plantas, sendo que estas obervações, tornam ainda mais complexa, a interpretação dos dados de expressão diferencial, quando se utiliza material vegetal cultivado em condições de campo.
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE GENES CANDIDATOS PARA A TOLERÂNCIA À SECA EM CLONES DE CAFÉ CONILON (Coffea canephora)
(2009) Vinecky, Felipe; Alves, Gabriel Sérgio Costa; Freire, Luciana Pereira; Vieira, Natalia Gomes; Marraccini, Pierre; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
O cenário da cafeicultura mundial, mostra o quanto esta cultura é importante economicamente, para diversos países. Para o Brasil, que é o maior produtor e exportador de café, esta commoditie é geralmente, uma das principais fontes de renda para pequenos produtores. A seca, que vem se tornando cada vez mais intensa ao longo dos anos, prejudica a produção desses agricultores, pois reduz a produtividade, podendo causar até a perda da lavoura. Atualmente, a elucidação dos fatores genéticos que conferem tolerância à seca em espécies vegetais é uma prioridade de vários grupos de pesquisa. As respostas ao déficit hídrico certamente envolvem mudanças na expressão gênica e o primeiro objetivo do presente trabalho foi caracterizar essas alterações por meio da caracterização do perfil da expressão gênica em folhas de um clone de C. canephora sensível (clone 22) e um clone tolerante (clone 14), cultivados em condições controle e de estresse hídrico. A técnica que foi utilizada neste trabalho foi a hibridização com macroarranjos de DNA, a qual se mostrou eficiente para se identificar genes diferencialmente expressos entre os tratamentos utilizados (irrigado e não irrigado), assim como diferenciais entre os materiais genéticos estudados (clone tolerante x sensível). Esses genes diferencialmente expressos são potenciais candidatos para a tolerância à seca em cafeeiro e podem ser objeto de estudos experimentais posteriores. Os genes selecionados nos experimentos de macroarranjos, foram também caracterizados utilizando-se a técnica de PCR quantitativo em tempo real (qPCR).. Em sua maioria, os resultados obtidos com as análises de qPCR corroboraram com a expressão diferencial previamente observada nos experimentos com macroarranjos.