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Análise in silico de genes potencialmente envolvidos na reação de hipersensibilidade em Coffea arabica
(2007) Sato, Juliana H.; Silva, Marilia S.; Campos, Magnolia de Araujo; Sá, Maria Fátima Grossi de; Mehta, Angela; Embrapa - Café
A reação de hipersensibilidade (HR) é uma das principais estratégias de defesa da planta tanto contra estresses bióticos quanto abióticos. A HR é geneticamente determinada e envolve a morte programada da célula vegetal infectada ou sob estresse abiótico para conseqüente contenção física de patógenos ou de efeitos negativos de condições ambientais adversas. A célula vegetal que codifica genes relacionado a HR, quando sensibilizada por estresses bióticos ou abióticos, ativa genes produzindo enzimas que participam da HR, tais como a lipoxigenase e a caspase. As caspases participam como chave para o desencadeamento da morte programada da célula vegetal, enquanto o metabolismo da lipoxigenase conduz à formação de moléculas regulatórias e importantes produtos associados ao sabor e aroma das plantas. A análise desses genes no Banco Genoma Funcional do Café (CafEST) revelou várias seqüências expressas relacionadas a caspases e lipoxigenases em diferentes tecidos sob condições de estresse tais como ataques de patógenos e déficit hídrico. Estes genes foram caracterizados in silico e analisados através da construção de uma árvore filogenética.
Análise in silico dos ESTs isolados de Coffea arabica infestada com Meloidogyne paranaensis
(2007) Albuquerque, Erika V.S.; Silva, Marilia S.; Teixeira, Cristiane de Camargo; Campos, Magnolia de Araujo; Sá, Maria Fátima Grossi de; Silva, Felipe R. da; Embrapa - Café
O ataque dos nematóides constitui grande problema fitossanitário para a cultura do café pelos grandes prejuízos que causam e pela dificuldade de controle. Entretanto, é difícil o melhoramento de C. arabica para a introgressão de fontes de resistência caracterizadas em C. canephora. A base do conhecimento da genética funcional do cafeeiro recebeu grande aporte de informações pela implementação do Projeto Genoma Café Brasileiro (CafEST), cujo banco de dados reuniu seqüências expressas em diferentes tecidos e tratamentos em C. arabica, C. canephora e C. racemosa . Foram gerados mais de 30 mil unigenes, a partir de 154770 reads presentes nas bibliotecas do CafEST. Entretanto, apenas 6483 reads são oriundos de raiz, sendo que a maior parte destes (76%) provém de uma biblioteca de estresse abiótico. Apenas 302 reads, que na sua maioria são singlets, correspondem à biblioteca desafiada com nematóide (NS1), em uma condição de interação compatível com cafeeiro suscetível. Neste trabalho foram feitas análises da biblioteca NS1 no contexto do CafEST com o auxílio das ferramentas desenvolvidas no Laboratório de Bioinformática da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. A busca por seqüências específicas de NS1 gerou uma lista de 60 clusters (2 contigs e 58 singlets), que foram categorizados de acordo a similaridade com o banco de dados não redundante do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Os resultados de BlastX indicaram que metade dos clusters não está presente no banco (no hits), 40% tem origem vegetal e 10% são de microrganismos ou animais. A comparação da biblioteca NS1 com o restante das bibliotecas do CafEST, assim como com duas outras bibliotecas de raiz induzidas por estresse abiótico (bion e alumínio) demonstrou não haver expressão significativamente diferente pelo teste de Fisher. Como a biblioteca NS1 possui alto índice de novidade (94.7%) e pequeno agrupamento dos reads, pudemos inferir que mais bibliotecas de raiz em situações contrastantes devam ser geradas, principalmente de genótipos de café resistente e suscetível aos nematóides. Apesar das limitações da biblioteca, foram encontradas seqüências compatíveis ao estresse aplicado. O entendimento da relação com os patógenos e dos mecanismos da resistência do cafeeiro são ainda bastante incipientes, especialmente em relação aos nematóides. Assim, este estudo faz parte da proposta de alguns projetos em execução que utilizam técnicas moleculares como abordagem da interação entre o Meloydogine e o cafeeiro. Com o entendimento dos mecanismos de resposta da planta envolvidos nesta interação, serão isoladas seqüências que possam ser utilizadas para o melhoramento de cultivares e possibilitar a conseqüente obtenção de plantas resistentes.
Avaliação da atividade antimicrobiana das defensinas recombinantes de ervilha (Drr230a) e café (CD1) produzidas em pichia pastoris
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2015-06-30) Lacerda, Ariane Ferreira; Sá, Maria Fátima Grossi de
A ineficácia de pesticidas químicos no controle de fungos fitopatogênicos na agricultura e a frequente incidência de doenças humanas causadas por bactérias resistentes a antibióticos levam à busca por compostos antimicrobianos alternativos. Neste contexto, defensinas vegetais constituem uma promissora ferramenta no controle de agentes patogênicos tanto de plantas quanto de humanos. Defensinas de plantas são peptídeos catiônicos com aproximadamente 50 resíduos de aminoácidos, ricas em cisteínas e cuja estrutura tridimensional é bastante conservada entre as diferentes espécies vegetais. Estas moléculas de ação antimicrobiana representam um importante componente inato da resposta de defesa vegetal contra patógenos e são expressas em diversos tecidos da planta, como folhas, tubérculos, flores, vagens e sementes. O presente trabalho teve por finalidade a avaliação da atividade antimicrobiana de duas defensinas vegetais contra diferentes espécies de fungos fitopatogênicos e bactérias patogênicas ao homem. A defensina Drr230a, cujo gene foi isolado de ervilha (Pisum sativum) e a defensina CD1, cujo gene foi identificado no transcriptoma de café (Coffea arabica) foram subclonadas em vetor de expressão de levedura e expressas em Pichia pastoris. O gene cd1 foi subclonado em duas formas recombinantes: CD1tC, contendo uma sequência codificante para seis histidinas (6xHis) na região C- terminal do peptídeo e CD1tN, contendo sequência codificante para 6xHis na região N-terminal. No caso da defensina Drr230a, a sequência codificante para 6xHis foi inserida apenas na região N-terminal da proteína. Ensaios de atividade antimicrobiana das proteínas recombinantes purificadas rDrr230a e rCD1 contra Phakopsora pachyrhizi, agente causal da ferrugem asiática da soja, foram realizados para analisar a inibição da germinação de esporos in vitro e a severidade da doença causada pelo fungo in planta. As duas defensinas recombinantes testadas foram capazes de inibir a germinação de uredosporos de P. pachyrhizi, não havendo diferença entre a ação antimicrobiana de CD1tC e CD1tN. Ademais, rDrr230a e rCD1 reduziram drasticamente a severidade da ferrugem asiática da soja, conforme demonstrado em ensaios in planta. Apesar de rCD1 não ter sido capaz de inibir a proliferação das bactérias patogênicas humanas Staplylococcus aureus e Klebsiella pneumoniae, rCD1 mostrou-se capaz de inibir o crescimento do fungo fitopatogênico Fusarium tucumaniae, causador da síndrome da morte súbita da soja. Os resultados obtidos mostram que tais defensinas vegetais são candidatas úteis para serem utilizadas em programas de engenharia genética de plantas para controlar doenças fúngicas impactantes na agricultura.
Construção de bibliotecas de cDNA de diferentes fases da embriogênese somática em café
(2003) Santos, Suzana Neiva; Tinoco, Maria Laine P.; Sá, Maíra Grossi de; Junqueira, Cristina Salgado; Soares, Alexandre F.; Andrade, Alan Carvalho; Teixeira, Joao Batista; Batista, João A. N.; Sá, Maria Fátima Grossi de; Silva, Felipe R. da; Borges, Carlos R.; Romano, Eduardo; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
Embriogênese somática (ES) é reconhecida como uma ferramenta biotecnológica importante para regeneração e multiplicação de plantas economicamente importantes. Apesar de café ser uma cultura de alto valor comercial e ES ter sido estabelecida desde 1970, não existem estudos bioquímicos e moleculares que permitam compreender e controlar este processo nesta cultura. O racional deste trabalho é a comparação dos genes que são expressos em genótipos contrastantes (como Coffea arabica e C. canephora) em relação à competência embriogênica e em diferentes fases do processo de ES. Para atingir estes objetivos foram construídas bibliotecas de cDNA de C. arabica e C. canephora nas fases de: folha, folha induzida por 2,4-D, calo primário e calo embriogênico. Dez mil clones advindo destas bibliotecas estão sendo seqüenciados e analisados. A compreensão dos mecanismos que governam o processo de ES se constitui em uma ferramenta valiosa para o melhoramento convencional já que permite a multiplicação de indivíduos F1 advindos de programas de melhoramento. Por outro lado, o controle deste processo também será extremamente importante para introdução de características que aumentem a qualidade da cultura, através de engenharia genética.
ESTs de Coffea arabica do tipo genes R classe 3 identificadas no CafEST
(2007) Campos, Magnolia de Araujo; Silva, Flávia B.; Silva, Marilia S.; Albuquerque, Erika V.S.; Teixeira, Cristiane de Camargo; Mehta, Angela; Sá, Maria Fátima Grossi de; Embrapa - Café
Café é uma importante commodity e um dos produtos agrícolas mais comercializados e consumidos no mundo. Por isso, o seqüenciamento em larga escala de seqüências expressas (ESTs) em órgãos de espécies de cafeeiro foi realizado e resultou na formação do banco de dados brasileiro do genoma funcional de café (CafEST). Apesar da produção e consumo de Coffea arabica corresponder à cerca de 70% do mercado de café, essa espécie é altamente susceptível a nematóides, pragas e patógenos. Portanto, há um crescente interesse de programas de melhoramento genético de cafeeiro em desenvolver variedades de C. arabica com resistência a esses agentes fitopatológicos. Inúmeros genes de resistência (genes R) já foram isolados de várias plantas e foram agrupados em classes de 1 a 6. Com o objetivo de elucidar se subclasses das 6 classes de genes R estão representadas nos genomas de espécies de café, uma estratégia de identificação de genes baseada em mineração de dados genômicos está sendo empregada para selecionar ESTs do banco CafEST que representem cada classe e subclasse já descrita. O presente trabalho relata a presença de um total de 293 ESTs relacionadas com genes R classe 3 (genes do tipo LRR/NBS/TIR) no genoma de C. arabica, as quais foram identificadas dentro do banco CafEST por homologia no BLAST. Dentre essas seqüências, 101 representam a subclasse RPP4 e foram agrupadas em 56 clusters. Adicionalmente, 93 ESTs representando a subclasse RPP5 foram encontradas e agrupadas em 46 clusters. Finalmente, as últimas 99 ESTs encontrados representam a subclasse RPS4 e foram agrupadas em 54 clusters. No entanto, nenhuma EST foi encontrada representando as outras subclasses de genes R classe 3 (L, M, N, P e RPP1) no banco CafEST com base nos critérios empregados. A estratégia usada para selecionar ESTs de C. arabica que potencialmente codificam genes R classe 3 dentro do CafEST permitiu a identificação de vários prováveis genes.
Exploração do banco de dados CafEST em busca de prováveis genes de Coffea arabica envolvidos na biossíntese de fenilpropanóides
(2007) Campos, Magnolia de Araujo; Medeiros, Fernanda C.L.; Pereira, Lívia M.; Resende, Mário Lúcio Vilela de; Silva, Marilia S.; Mehta, Angela; Sá, Maria Fátima Grossi de; Embrapa - Café
Compostos naturais denominados fenilpropanóides apresentam funções na defesa vegetal, desempenhando papéis tanto na defesa pré-existente quanto na defesa induzida local e sistêmica em resposta ao ataque de patógenos. Prováveis genes que codificam para cada uma das 21 enzimas-chave envolvidas na biossíntese de fenilpropanóides em C. arabica foram identificados dentro do banco de dados brasileiro de genoma funcional de café (CafEST). De um total de 3559 ESTs selecionadas , 101 ESTs provavelmente representam a classe fenilalanina-amônia-liase (PAL). PAL catalisa a reação de desaminação de fenilalanina para gerar ácido cinâmico, dando início à rota dos fenilpropanoides. Os maiores números de ESTs, 521 e 490, foram encontrados representando as classes das enzimas cinamato 4-hidroxilase (C4H) e isoflavona O-metil-transferase (IOMT), respectivamente. Os menores números de ESTs encontrados, 21 e 36, representam as classes das enzimas chalcona isomerase (CHI) and cafeoil coenzima A O-metil-transferase (CCOMT). Análise detalhada dos 11 clusters de ESTs do tipo PAL revelou que seqüências de aminoácidos deduzidas compartilham alta similaridade (84-100%) com proteínas PAL isoladas das plantas Coffea canephora, Ipomoea nil, Catharanthus roseus, Jatropha curcas e Ulmus pumila. Além disso, a presença de uma possível ORF completa foi revelada. Ainda foi possível observar que das 101 ESTs identificadas para a classe PAL, 38 foram expressas em folhas de C. arabica sob diferentes condições, sendo a maioria encontrada em folhas de ramos plagiotrópicas de plantas adultas não tratadas com Bion. As ESTs do tipo PAL expressas em folhas estão presentes em 5 dos 6 contigs e em 2 singlets. A análise de ‘neighbour-joining’ gerou um filograma que agrupou cinco seqüências oriundas de contigs do tipo PAL de C. arabica em dois grupos maiores. A presença de possíveis membros de todas as enzimas-chave envolvidas na biossíntese de fenilpropanóides no genoma de C. arabica ainda não tinha sido relatada. Os prováveis genes identificados neste trabalho são candidatos para análises in silico e experimentais sobre o perfil de expressão. A elucidação da via de biossíntese de fenilpropanóides no metabolismo de café pode gerar impactos sobre o desfecho da resistência a doenças nesta cultura economicamente importante, levando a ganhos positivos sobre o agronegócio cafeeiro.
Expressão de fatores de transcrição tipo WRKY no banco genoma funcional de café (Coffea sp.)
(2007) Cordeiro, Maria Cristina R.; Silva, Marilia S.; Martins, Natália F.; Sá, Maria Fátima Grossi de; Embrapa - Café
A expressão de genes relacionados a fatores de transcrição tipo wrky no genoma funcional do café foi avaliada. Foram observadas 227 reads relacionadas com proteínas WRKY no Coffea arabica, 205 reads no Coffea canephora e 10 reads no Coffea racemosa. Dentre as seqüências que apresentaram homologia com proteínas WRKY encontram-se seqüências de proteínas que apresentam o domínio NBS-LRR em sua estrutura assim como proteínas relacionadas a genes de resistência de espécies diferentes. As seqüências obtidas estão relacionadas a diferentes situações fisiológicas em especial desenvolvimento, estresse biótico e abiótico.
Expressão diferencial de proteínas em raízes de Coffea canephora infectadas com o nematóide endoparasita Meloidogyne paranaensis
(2005) Andrade, Aretusa E.; Albuquerque, Erika V.S.; Sá, Maria Fátima Grossi de; Carneiro, Regina M. D. Gomes; Mehta, Angela; Embrapa - Café
Muitos estudos têm focado na caracterização funcional de proteínas codificadas por genes de resistência a diversos patógenos. Neste estudo, a expressão de proteínas durante a interação entre a planta de café resistente, Coffea canephora e o patógeno Meloidgyne paranaensis foi realizada. Raízes de C. canephora foram infectadas com inóculos do nematóide na fase de juvenis (J2) com aproximadamente 1000 larvas por planta no total de 24 plantas. As raízes foram coletadas em um intervalo de tempo de 3, 6 e 10 dias após a infecção. Raízes não infectadas foram utilizadas como controle. As raízes foram lavadas com uma solução de água e hipoclorito de sódio a 10%; congeladas e armazenadas a -80ºC . O material foi utilizado para extração de proteínas, que foram submetidas a eletroforese bidimensional (2-DE). Os resultados obtidos através de 2-DE revelaram várias proteínas diferenciais nos diferentes tempos após a infecção quando os mapas foram comparados à condição controle. Na análise dos mapas de tempo 3 , 5 proteínas diferencias foram visualizadas. Enquanto que os mapas de tempo 6 e 10 revelaram 6 e 5 proteínas diferenciais, respectivamente. Essas proteínas deverão ser identificadas através de espectrometria de massa na tentativa de associá-las ao processo de resistência ao nematóide Meloidgyne ssp , já que os mecanismos de defesa de plantas envolvem a expressão de proteínas específicas associadas ao reconhecimento do patógeno, ativando uma gama de outras proteínas responsáveis pela resistência.
Identificação de prováveis genes R classe 1 e 2 de Coffea arabica no Banco Brasileiro Genoma Funcional de Café (CafEST)
(2007) Silva, Marilia S.; Albuquerque, Erika V.S.; Teixeira, Cristiane de Camargo; Campos, Magnolia de Araujo; Mehta, Angela; Martins, Natália F.; Sá, Maria Fátima Grossi de; Embrapa - Café
O café é um produto agrícola tradicional da economia brasileira que representa 2,4% do valor total das exportações e gera cerca de 8 milhões de empregos. O Brasil produz aproximadamente 40% do café comercializado no mercado internacional, além de ser o segundo maior consumidor mundial desse produto, particularmente da espécie Coffea arabica. Apesar da produção e consumo de C. arabica corresponder à cerca de 70% do mercado de café, essa espécie é altamente susceptível a nematóides, pragas e doenças. Portanto, há um crescente interesse de programas de melhoramento genético de cafeeiro em desenvolver variedades de C. arabica com resistência a nematóides, pragas e doenças. Um grande número de genes de resistência (genes R) de plantas já foi isolado e classificado em seis grupos denominados classe 1- classe 6. A maioria dos genes R conhecidos pertence à classe 2 e codifica proteínas que contêm os seguintes domínios em sua sequência: nucleotide binding site (NBS), leucine-rich repeat (LRR) e, no N-terminal, um domínio leucine-zipper (LZ) ou outra sequência coiled-coil (CC). A classe 1 compreende genes R homólogos ao membro tipo dessa classe, que é o gene R denominado pto, o qual codifica uma proteína que apresenta o domínio catalítico de serina/treonina quinase e regiões de miristilação em sua porção N-terminal. Seqüências aminoacídicas bem descritas correspondentes a genes R das classes 1 e 2 foram usadas para rastrear o Banco Brasileiro Genoma Funcional de Café (CafEST) por sequências de ESTs homólogas de genes R classes 1 e 2 em C. arabica. Os ESTs selecionados nessa busca foram agrupados em clusters (contigs ou singlets), os quais foram subseqüentemente analisados quanto a homologias com genes R disponíveis em banco de dados públicos. Alinhamentos múltiplos entre seqüências de aminoácidos deduzidas a partir das seqüências consensos dos contigs do tipo genes R do CafEST e seqüências homólogas foram usados para gerar filogramas. Os filogramas gerados indicam ambas as classes 1 e 2 de prováveis genes R de C. arabica estão consideravelmente representadas no CafEST, um vez que alto número total de ESTs foi recuperado quando do rastreio desse banco, ou seja, 525 ESTs homólogos a genes R classe 1, agrupados em 262 clusters (118 contigs e 144 singlets), e 449 ESTs homólogos a genes R classe 2 agrupados em 190 clusters (82 contigs e 108 singlets), perfazendo um total de 973 ESTs e 452 clusters (200 contigs e 252 singlets). Ademais, os filogramas mostram que as seqüências de aminoácido deduzidas a partir de contigs de C. arabica do CafEST podem ser agrupadas em quatro grupos de prováveis genes R classe 1 e quatro grupos de prováveis genes R classe 2, além de mostrar que as seqüências desses contigs são consideravelmente homólogas às seqüências conhecidas de genes R usadas para rastrear o CafEST. Análises de domínios típicos de proteínas R estão em andamento e poderão adicionar novas informações a estes dados. Esse estudo vai auxiliar o futuro desenvolvimento de marcadores moleculares correlacionados com marcadores genéticos de resistência em cafeeiro e o futuro isolamento de sequências completas de genes R de C. arabica que poderão ser usados em transgenia de plantas.
Identificação de prováveis genes R classe 2 análogos ao gene Mi de tomate no banco brasileiro de ESTs genoma funcional do café (CafEST)
(2007) Teixeira, Cristiane de Camargo; Albuquerque, Erika V.S.; Silva, Marilia S.; Martins, Natália F.; Mehta, Angela; Sá, Maria Fátima Grossi de; Campos, Magnolia de Araujo; Embrapa - Café
A cultura do café impõe um constante desafio aos produtores, devido ao grande número de problemas de doenças e pragas que ocorrem durante praticamente todo o ciclo. Apesar de ser um produto agrícola comercial tradicional da economia brasileira, as cultivares apresentam alta susceptibilidade a pragas e doenças. Esses problemas fitossanitários têm aumentado os danos à cultura e a contaminação ambiental. Portanto, grandes esforços têm sido realizados por diferentes equipes de melhoristas no sentido de obtenção de cultivares de café que combinem alto rendimento com resistência a estresses bióticos e abióticos e boa qualidade de bebida. O desenvolvimento de cultivares melhoradas é um desafio para aumentar a sustentabilidade do agronegócio café. Genes de resistência (R) tem sido isolados em várias espécies de plantas, sendo que a grande maioria destes genes R possuem o domínio NBS (Nucleotide binding site). Os genes R que possuem esse domínio estão classificados como pertencentes a classe 2 de genes R. Utilizamos para rastrear seqüências no Banco Brasileiro de ESTs Genoma Funcional de Café (CafEST) a seqüência do gene de resistência Mi do tomate, por ser uma seqüência bem descrita e conhecida, e também pelo fato do tomate pertencer a uma família próxima a família do café. As seqüências isoladas do CafEST foram agrupadas formando contigs (duas ou mais seqüências homólogas) e seqüências únicas (singlets). As seqüências consenso dos contigs foram blastadas contra o banco de dados NCBI para confirmar a homologia com genes R já descritos e para encontrar as fases abertas de leitura (ORFs - Open Reading Frame) e possíveis domínios conservados. As seqüências de aminoácido das ORFs foram analisadas e alinhadas, e um filograma foi gerado. O filograma gerado indica a existência de várias seqüências no CafEST homólogas a genes de resistência e também homólogas ao gene de resistência Mi do tomate. Esta análise confirma a eficiência de buscar seqüências homólogas a genes de resistência utilizando-se seqüências ancoras de genes conhecidos, auxiliando o desenvolvimento de marcadores moleculares para seleção assistida por marcadores, mapeamento genético e isolamento de genes de resistência no café.
Identificação de sequências NBS-RGA de Coffea canephora
(2003) Barros, Érika V. S. A.; Fragoso, Rodrigo R.; Machado, Flávia R.; Bertioli, David; Sá, Maria Fátima Grossi de; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
C. arabica é uma espécie altamente susceptível a pestes e doenças. Os nematóides causam danos severos às plantações de café do Brasil. Atualmente, as espécies de Meloidogyne mais agressivas são M. incognita, M. paranaensis e M. exigua. Neste trabalho são descritos os resultados obtidos da amplificação do DNA de um genótipo de C. canephora resistente ao M. paranaensis através de iniciadores degenerados desenhados para se ligarem ao domínio NBS (nucleotide binding site) dos RGAs (resistance genes analogues) em estudo. Os clones positivos foram seqüenciados e os dados resultantes analisados com os programas Blastx, Staden e Clustal. As análises revelaram que foram isoladas seqüências do tipo NBS, conforme esperado. A comparação das sequências traduzidas revelou correlação com os genes de resistência já descritos em diferentes espécies de plantas. As seqüências tipo NBS clonadas serão úteis na busca dos genes completos de C. canephora que possam ser testados para a conferência de resistência aos nematóides em plantas modelo, com a finalidade futura de desenvolver genótipos elite de C. arabica resistentes aos nematóides.
Inibidores de [alfa]-amilase e sua aplicação no controle da broca-do-café
(2007) Barbosa, Aulus Estevão Anjos de Deus; Barros, Érika V. S. A.; Teixeira, Joao Batista; Sá, Maria Fátima Grossi de; Embrapa - Café
O Brasil é o maior produtor mundial de café, detendo 36% do mercado, e as espécies Coffea arabica (65%) e Coffea canephora (35%) são as mais comercializadas. As plantações de café são atacadas por uma série de pragas agrícolas, sendo a principal delas a broca-do-café (Hypothenemus hampei). Este coleóptero é bastante difícil de ser controlado, pois passa todo o ciclo de vida protegido dentro do fruto do café. O controle é restrito a utilização de inseticida carcinogênico e tóxico para o meio ambiente. Recentemente, foi demonstrando em experimentos in vitro que o inibidor [alfa]-AI1 do feijão Phaseolus vulgaris inibe a atividade das duas [alfa]-amilases presentes no trato intestinal da broca-do-café. Em nosso grupo de trabalho foi demonstrado que um inibidor de [alfa]-amilase presente em acessos do feijão selvagem Phaseolus coccineus ([alfa]IPC) é altamente ativo contra [alfa]-amilases desta praga. A disponibilidade em nosso laboratório destes gene e de técnicas eficientes para transformar geneticamente C. arabica e C. canephora tornaram possível a obtenção de plantas de café transformadas com o gene do inibidor [alfa]-AI1 e de embriões selecionados com o inibidor [alfa]IPC para o controle da broca. Utilizando a técnica de biobalística em calos embriogênicos de C. arabica foram obtidas 6 plantas positivas para o gene [alfa]-AI1, já identificadas via Southern Blot. Estas plantas apresentaram baixo número de cópias, 5 delas com 1 cópia e apenas uma planta com duas cópias do gene. Duas das plantas positivas por Southern Blot estão produzindo frutos e logo será possível avaliar o nível de expressão do inibidor [alfa]-AI1e a atividade dos frutos transgênicos no controle da broca-do-café via bioensaios. Os calos embriogênicos de C. arabica e C. canephora transformados com o inibidor de alfa-amilase do feijão Phaseolus coccineus estão em meio de indução de regenerando embriões dos calos selecionados. O resultado deste trabalho poderá resultar em cultivares de café menos impactantes ao meio ambiente, tornando o café brasileiro mais competitivo no mercado internacional.
Inibidores protéicos e seu potencial uso no controle de insetos-praga de importância para a cultura do café e do feijão
(Universidade Federal de Santa Maria, 2005) Pereira, Railene de Azevedo; Sá, Maria Fátima Grossi de
Os inibidores de α-amilase e de proteinases vegetais tem sido amplamente estudados, devido ao papel destes fatores de resistência contra insetos-praga. Este trabalho tem como objetivo identificar inibidores de α-amilase e de proteinases, presentes em sementes de Phaseolus coccineus e sementes de algaroba (Prosopis juliflora), com potencial inseticida no controle da broca-do-café (Hypothenemus hampei) e de pragas de grãos armazenados de feijão Acanthoscelides obtectus e Callosobruchus maculatus. Um gene que codifica para o inibidor de α-amilase de 223 resíduos de aminoácidos, denominado α AI-Pc1 foi clonado de sementes de Phaseolus coccineus, acesso 35590. αAI- Pc1 tem 70 a 98% de identidade de aminoácidos com outros inibidores de α-amilases de feijão, já descritos. Uma construção contendo o gene α AI-Pc1, regulado pelo promoter da fitohemaglutinina PHA-L, foi introduzida em plantas de fumo, via Agrobacterium tumefasciens. A presença e expressão do gene α AI-Pc1 em plantas transformadas (parental T0 e geração T1) foi confirmada por reação de cadeia da polimerase (PCR), Western blot e ELISA. Extrato protéico das sementes de plantas transformadas reagiram positivamente com o anticorpo policlonal contra o anticorpo αAI-1, enquanto que nenhuma reação foi observada em plantas não transformadas. Ensaios imunológicos mostraram que αAI-Pc1 representa cerca de 0,05% da proteína solúvel total de sementes de plantas (T0). A proteína recombinante expressa em plantas de fumo foi biologicamente ativa onde 125 ng de inibidor αAI-Pc1 inibe 65% da atividade da α-amilase de H. hampei. Utilizando semente de P. coccineus, acesso 35619, um inibidor de proteinase serínica pertencente à classe Bowman-Birk foi purificado utilizando técnicas cromatográficas que incluem coluna de troca iônica DEAE-Cellulose, coluna de filtração molecular Superdex 75, coluna fase-reversa líquida de alta pressão Vydac C-18 e Source 5RPC. O inibidor, denominado de PcBBI1, é uma proteína rica em cisteína e estável ao calor em pH alcalino. Análises por MALDI-TOF/MS mostraram que o inibidor PcBBI1 esta presente em semente de P. coccineus na forma de um monômero de 8.689 Da ou de um dímero de 17.378 Da. O efeito inibitório de PcBBI1 foi analisado por ensaio in vitro para tripsina e quimotripsina pancreática bovina e para proteinases digestivas de larvas de H. hampei. O inibidor foi fortemente ativo contra as enzimas semelhantes à tripsina de H. hampei, inibindo 80% da atividade proteolítica. Adicionalmente, um inibidor de proteinase cisteínica foi isolado das sementes de algaroba (Prosopis juliflora). Este inibidor, denominado de Pj, foi purificado usando uma coluna de filtração molecular Sephacryl S-200 seguido por uma coluna de fase-reversa líquida de alta pressão Vydac 18 TP. O inibidor Pj mostrou uma massa molecular de 20.000 Da por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS e massa molecular de 19.276 Da por espectrometria de massa. A inibição da papaína pelo inibidor Pj foi do tipo não-competitivo, com um valor de K i de 0.59 x 10 -9 . A atividade gelatinásica da papaína também foi fortemente inibida pelo inibidor Pj. A seqüência de aminoácidos da extremidade N-terminal do inibidor Pj mostrou homologia com a seqüência de aminoácidos da extremidade N-terminal de inibidores de proteinase da família Kunitz. Pj foi fortemente efetivo contra proteinases digestivas do gorgulho do feijão Acanthoscelides obtectus e do gorgulho de caupi Callosobruchus maculatus e foi moderadamente ativo contra proteinases digestivas do gorgulho da vagem Mimosestes mimosae e do gorgulho do feijão comum Zabrotes subfasciatus.