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Análise proteômica de embriões zigóticos e endosperma em sementes de Coffea arabica
(2007) Koshino, Lívia L.; Andrade, Aretusa E.; Silva, Luciano P. da; Bloch, Carlos; Franco, Octávio L.; Eira, Mírian T. S.; Teixeira, Joao Batista; Mehta, Angela; Embrapa - Café
Durante o desenvolvimento da semente de café, proteínas vão sendo depositadas, predominantemente nos cotilédones e no endosperma. As proteínas de reserva 11S são as globulinas mais abundantes na semente de café agindo como fonte de nitrogênio nas reações de torra e garantindo o sabor e aroma característicos. Este estudo teve como objetivo analisar o perfil de proteínas expressas em endosperma e embrião zigótico de sementes de café. Proteínas foram extraídas da semente inteira, e também do endosperma e embrião de café, isoladamente. Em seguida, as proteínas foram analisadas por eletroforese bidimensional (2-DE) e posteriormente por espectrometria de massa. Os spots mais abundantes observados no gel de proteínas de semente inteira foram excisados, tripsinizados e identificados como subunidades da proteína 11S através de espectrometria de massa. Spots com o mesmo pI e massa molecular foram também observados no perfil de proteínas do endosperma e embrião, indicando que a proteína 11S é também muito expressa nesses tecidos. Foi possível identificar algumas destas proteínas, que mostraram identidade com a proteína de reserva 11S de café. Foi obtida uma cobertura de seqüência de peptídeos de aproximadamente 20% de toda a proteína 11S. Duas proteínas diferenciais presentes no endosperma foram também analisadas por espectrometria de massa e identificadas através de seqüenciamento de novo como uma glubulina da mesma família da 11S (Cupin superfamily) e uma proteína alergênica (Pru ar 1).
Avaliação do ácido cítrico na multiplicação e regeneração de calo embriogênico friável de café (Coffea arabica L.)
(2003) Junqueira, Cristina Salgado; Teixeira, Joao Batista; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
A embriogênese somática em café (Coffea arabica L.) depende da produção de calos embriogênicos friáveis, os quais devem ser multiplicados de tal forma a permitir a produção de um estoque mínimo de células. A multiplicação em meio gelificado, embora possível, não é a forma mais apropriada para induzir um aumento satisfatório do estoque inicial de células embriogênicas. O meio líquido, por sua vez, constitui a forma mais adequada para induzir a multiplicação celular. Visando preparar inóculo de células embriogênicas para uso em biorreatores, amostras de calos embriogênicos friáveis obtidos de folhas de ‘Catuaí Vermelho’ foram inoculadas em meio líquido em Erlenmeyers mantidos sob agitação a 100 rpm, no escuro, sob temperatura de 25-27ºC. A densidade de células inoculadas foi de 10,0 g/L, tendo sido testado ácido cítrico nas concentrações de 0,0; 250,0 e 500,0 mg/L. O meio de cultura utilizado foi o de MS, meia força, suplementado, por litro, de 10 mg de tiamina, 1 mg de piridoxina, 1 mg de ácido nicotínico, 1 mg de glicina, 100 mg de mio-inositol, 10 mg de L-cisteína, 100 mg de caseína hidrolisada, 200 mg de extrato de malte e 2% de sacarose. Como reguladores de crescimento, foram adicionados 2,0 mg/L de 2,4-D, 2,0 mg/L de 2-iP e 1,0 mg/L de IBA. A taxa de aumento no peso da matéria fresca foi calculada pela formula TCR=(lnPFf-lnPFi)/t, sendo PFf o peso da matéria fresca final, PFi o peso da matéria fresca inicial e t o tempo em dias. O tempo de dobramento da material fresco foi calculado pela formula dt=0,693/TCR. O subcultivo foi conduzido a cada 15 dias e a avaliação do peso da matéria fresca, aos 30 dias. A TCR foi maior em todos os tratamentos para os períodos de 30 e 60 dias, variando de 0,0459 a 0,0707 g/g/dia, com um dobramento da matéria fresca a cada 9,8 a 15,1 dias. Por outro lado, a TCR foi consideravelmente menor aos 90 dias de cultivo, com TCR variando de 0,0331 a 0,0390 g/g/dia e um dobramento de peso entre 17,8 a 21,1 dias. Após 30 dias de cultivo em meio de multiplicação, amostras de células embriogênicas foram retiradas e inoculadas em meio de regeneração, contendo meio básico, acrescido de 2,0 mg/L de BAP e 0,25 mg/L de ANA, na ausência de ácido cítrico. A avaliação final foi conduzida após 60 dias de cultivo, com a pesagem total dos embriões, retirada de uma amostra, pesagem e contagem dos embriões na amostra. A TCR dos embriões variou de 0,0380 a 0,0555 g/g/dia, com um tempo de dobramento do peso de 12,5 a 18,3 dias. A TCR foi menor na concentração correspondente a 500,0 mg/L de ácido cítrico. O número de embriões por grama de calos embriogênicos inicialmente inoculados foi de 390, 4.703 e 18.729, respectivamente, para as concentrações de 0,0; 250,0 e 500,0 mg/L de ácido cítrico utilizadas no meio de multiplicação. Pelo menos tomando como referência o presente experimento, a presença de ácido cítrico no meio de multiplicação contribuiu para a manutenção da capacidade regenerativa de embriões a partir de calos embriogênicos de café.
Biorreator de imersão temporária desevolvido pela Embrapa - Recursos Genéticos e Biotecnologia
(2001) Teixeira, Joao Batista; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
A participação da mão-de-obra na produção de mudas via micropropagação pode chegar a 70% do custo final. Visando economia de mão-de-obra, a Embrapa-Recursos Genéticos e Biotecnologia deu início há alguns anos ao desenvolvimento de um biorreator de imersão temporária. Este sistema de cultivo foi escolhido tendo em vista que a maioria dos biorreatores publicados eram do tipo de imersão contínua e foram delineados para cultivo de células vegetais e de microrganismos, não constituindo a melhor alternativa para o cultivo de gemas e embriões somáticos. A construção do primeiro protótipo da Embrapa teve como referência o biorreator de imersão temporária desenvolvido pelo CIRAD, que é conhecido como sistema RITA. O sistema desenvolvido pela Embrapa é composto de pares de frascos ao contrário do sistema RITA, o qual consiste de dois compartimentos em um só frasco. No compartimento inferior o meio de cultura fica armazenado e, no superior, é mantido o explante. No sistema desenvolvido pela Embrapa, em um frasco é estocado o meio de cultura enquanto que no outro é feito o cultivo do explante, que podem ser células, gemas ou embriões somáticos. Os pares de frascos são conectados via canalização a um sistema de válvulas solenóides, as quais controlam a direção do fluxo de ar procedente do compressor, de acordo com a programação dos temporizadores eletrônicos, aos quais são conectadas as válvulas. Após testes preliminares, verificou-se um perfeito funcionamento do sistema, o qual está sendo avaliado para cultivo de calo e embrião somático de café.
Construção de bibliotecas de cDNA de diferentes fases da embriogênese somática em café
(2003) Santos, Suzana Neiva; Tinoco, Maria Laine P.; Sá, Maíra Grossi de; Junqueira, Cristina Salgado; Soares, Alexandre F.; Andrade, Alan Carvalho; Teixeira, Joao Batista; Batista, João A. N.; Sá, Maria Fátima Grossi de; Silva, Felipe R. da; Borges, Carlos R.; Romano, Eduardo; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
Embriogênese somática (ES) é reconhecida como uma ferramenta biotecnológica importante para regeneração e multiplicação de plantas economicamente importantes. Apesar de café ser uma cultura de alto valor comercial e ES ter sido estabelecida desde 1970, não existem estudos bioquímicos e moleculares que permitam compreender e controlar este processo nesta cultura. O racional deste trabalho é a comparação dos genes que são expressos em genótipos contrastantes (como Coffea arabica e C. canephora) em relação à competência embriogênica e em diferentes fases do processo de ES. Para atingir estes objetivos foram construídas bibliotecas de cDNA de C. arabica e C. canephora nas fases de: folha, folha induzida por 2,4-D, calo primário e calo embriogênico. Dez mil clones advindo destas bibliotecas estão sendo seqüenciados e analisados. A compreensão dos mecanismos que governam o processo de ES se constitui em uma ferramenta valiosa para o melhoramento convencional já que permite a multiplicação de indivíduos F1 advindos de programas de melhoramento. Por outro lado, o controle deste processo também será extremamente importante para introdução de características que aumentem a qualidade da cultura, através de engenharia genética.
Expressão do gene Gus em embriões zigóticos e calos embriogênicos de Coffea arabica e C. canephora
(2001) Barros, Érika V. S. A.; Cunha, Welcimar G. da; Teixeira, Joao Batista; Brasileiro, Ana Cristina M.; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
A metodologia de biolística foi utilizada para a transformação genética de Coffea spp. Foram bombardeados embriões zigóticos de C. arabica e calos embriogênicos de C. arabica e de C. canephora. Embriões da cultivar IAPAR 59 foram testados nos dias 2, 5, 7, 9 e 12 do período de cultivo anterior ao bombardeamento. A expressão transiente foi observada em 30 embriões de cada idade após 48 horas do bombardeamento, através de teste histoquímico com X-glu. Outros 30 embriões foram mantidos em meio seletivo com imazapyr 300 nM por 15 d. O maior número de pontos azuis nas análises transiente e estável da expressão do gene gus foi observado na idade de 12 d. Com base neste resultado, foram testados 700 embriões da cultivar Mundo Novo nas mesmas condições, sendo a expressão estável analisada em brotos emergentes após 60 d. Verificou-se que partes de alguns brotos apresentaram coloração azul, indicando a formação de mosaicos. O material de calos embriogênicos proveniente de folhas de cafeeiro foi bombardeado em meio C contendo 0; 0,25; e 0,5 M de manitol. Observou-se o maior número de pontos azuis na análise transiente de amostras dos calos submetidos a pré-tratamento osmótico, sugerindo que esta etapa possa otimizar a transformação deste material.
Fatores que influenciam a indução de calos embriogênicos em folhas de café (Coffea arabica L.)
(2003) Junqueira, Cristina Salgado; Teixeira, Joao Batista; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
A exploração da heterozigose em híbridos de café dependerá de uma tecnologia eficiente de multiplicação clonal. Como a clonagem via enxertia e estaquia apresenta uma baixa eficiência na espécie C. arabica, a embriogênese somática passa a ser a única alternativa potencialmente viável para a clonagem de genótipos selecionados. Entretanto, vários fatores influenciam a resposta embriogênica em folhas de plantas adultas de café. Dentre os inúmeros fatores que podem afetar a resposta embriogênica, foram avaliados, durante os últimos anos, a influência dos níveis de 2,4-D e sacarose no meio de cultura, de diferentes genótipos, de diferentes folhas e diferentes posições do explante na folha. Verificou-se que, após quatro a cinco meses de cultura, a freqüência de formação de calos embriogênicos foi maior nos níveis de 10 e 20 µM de 2,4-D e 2 e 3% de sacarose. Foram avaliados os seguintes genótipos: ‘Catuaí Vermelho’, ‘Acaiá Cerrado’, ‘Rubi’, ‘Mundo Novo’ e ‘Icatu Amarelo’. Todos os genótipos responderam com taxas relativamente elevadas, com exceção do ‘Mundo Novo’, para o qual se obtiveram alguns calos embriogênicos em centenas de explantes inoculados, uma taxa menor que 1,0%. Utilizando apenas o genótipo ‘Catuaí Vermelho’, observou-se influência da folha e da posição do explante na folha sobre a resposta embriogênica. Diferentes folhas apresentavam diferentes taxas embriogênicas e regiões apicais da folhas apresentavam uma freqüência maior de formação de calos embriogênicos que as regiões medianas e basais. A maior freqüência de calos embriogênicos foi obtida com a cultivar Catuaí Vermelho, para a qual se obteve até 90% dos explantes inicialmente inoculados, com presença de calos embriogênicos. O potencial embriogênico dos calos foi demonstrado com a indução de regeneração em meio gelificado e em meio líquido sob agitação.
Influência dos níveis de 2-iP e 2,4-D na embriogênese somática de folhas de plantas de Coffea canephora e Coffea arabica
(2001) Teixeira, Joao Batista; Arimura, Célia Tacaco; Junqueira, Cristina Salgado; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
A exploração da heterozigose em café depende da disponibilidade de uma eficiente metodologia de multiplicação vegetativa, a qual se encontra em fase de teste em escala piloto tanto para Coffea arabica quanto para Coffea canephora. Dos fatores do meio de cultura que influenciam a taxa de indução de embriogênese somática em café, isopenteniladenina (2-iP) e ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) têm um papel determinante no processo. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo avaliar as concentrações relativas de 2i-P e 2,4-D na indução de formação de calos embriogênicos do tipo HFSE ("High frequency somatic embryos") e LFSE ("Low frequency somatic embryos"), em uma cultivar de C. arabica (Catuaí Vermelho) e um genótipo de C. canephora (E1571/99). A formação de calo embriogênico do tipo LFSE foi estimulada pelo aumento de 2-iP, enquanto o do tipo HFSE foi estimulado pelo aumento de 2,4-D em ambas as espécies. Em C. canephora, a formação de LFSE e HFSE chegou a 100% na presença de 2,5, 5,0 ou 10.0 mM de 2-iP e 5,0 mM 2,4-D, respectivamente. Em C. arabica, a percentagem de formação tanto de LFSE quanto de HFSE foi menor, chegando a 63,6 de LFSE em 15 mM de 2-iP e 90,6% de HFSE em 20 mM de 2,4-D. O subcultivo aos 30 dias foi benéfico em explantes de C. arabica, o contrário do observado para explantes de C. canephora. Em geral, este subcultivo contribuiu para a formação e o crescimento de calo friável não-embriogênico, o que prejudicou a formação de LFSE em C. canephora.
Inibidores de [alfa]-amilase e sua aplicação no controle da broca-do-café
(2007) Barbosa, Aulus Estevão Anjos de Deus; Barros, Érika V. S. A.; Teixeira, Joao Batista; Sá, Maria Fátima Grossi de; Embrapa - Café
O Brasil é o maior produtor mundial de café, detendo 36% do mercado, e as espécies Coffea arabica (65%) e Coffea canephora (35%) são as mais comercializadas. As plantações de café são atacadas por uma série de pragas agrícolas, sendo a principal delas a broca-do-café (Hypothenemus hampei). Este coleóptero é bastante difícil de ser controlado, pois passa todo o ciclo de vida protegido dentro do fruto do café. O controle é restrito a utilização de inseticida carcinogênico e tóxico para o meio ambiente. Recentemente, foi demonstrando em experimentos in vitro que o inibidor [alfa]-AI1 do feijão Phaseolus vulgaris inibe a atividade das duas [alfa]-amilases presentes no trato intestinal da broca-do-café. Em nosso grupo de trabalho foi demonstrado que um inibidor de [alfa]-amilase presente em acessos do feijão selvagem Phaseolus coccineus ([alfa]IPC) é altamente ativo contra [alfa]-amilases desta praga. A disponibilidade em nosso laboratório destes gene e de técnicas eficientes para transformar geneticamente C. arabica e C. canephora tornaram possível a obtenção de plantas de café transformadas com o gene do inibidor [alfa]-AI1 e de embriões selecionados com o inibidor [alfa]IPC para o controle da broca. Utilizando a técnica de biobalística em calos embriogênicos de C. arabica foram obtidas 6 plantas positivas para o gene [alfa]-AI1, já identificadas via Southern Blot. Estas plantas apresentaram baixo número de cópias, 5 delas com 1 cópia e apenas uma planta com duas cópias do gene. Duas das plantas positivas por Southern Blot estão produzindo frutos e logo será possível avaliar o nível de expressão do inibidor [alfa]-AI1e a atividade dos frutos transgênicos no controle da broca-do-café via bioensaios. Os calos embriogênicos de C. arabica e C. canephora transformados com o inibidor de alfa-amilase do feijão Phaseolus coccineus estão em meio de indução de regenerando embriões dos calos selecionados. O resultado deste trabalho poderá resultar em cultivares de café menos impactantes ao meio ambiente, tornando o café brasileiro mais competitivo no mercado internacional.
Obtenção de mudas clonais de café (Coffea arabica L.) via embriogênese somática
(2005) Teixeira, Joao Batista; Pereira, Ana J. P.; Junqueira, Cristina Salgado; Mello, Raquel I.S. de; Silva, Ana Paula D. da; Mundim, Danielle A.; Embrapa - Café
A exploração da heterozigose, por meio de cruzamentos inter-varietais e inter-específicos, depende da disponibilidade de uma metodologia de multiplicação vegetativa. Esta metodologia é essencial, tanto para avaliação e seleção de clones em condições de campo quanto para plantios comerciais em larga escala das variedades híbridas após o seu lançamento. Visando revisar a metodologia de clonagem de café via embriogênese somática, experimentos foram conduzidos, nos quais foram utilizadas plantas matrizes de vários genótipos, cultivadas em casa de vegetação. Após a desinfestação, explantes de 0,5 x 0,5 cm aproximadamente foram inoculados em placas de Petri contendo 20 ml do meio básico de MS a 50%, acrescido de 4,9 mM de IBA, 9,8 mM de 2-iP e 20 mM de 2,4-D. Após 30 dias, os explantes foram transferidos para placas contendo o mesmo meio fresco, com redução do 2,4D para 10 mM, onde permaneceram por mais 90 a 120 dias até o aparecimento dos setores embriogênicos, quando foi feita a avaliação final. A taxa de formação de calos primários foi próxima de 100% para a maioria dos genótipos, enquanto que a taxa de formação de setores embriogênicos foi de 8,3; 36,8; 41,9; 100 e 84,3%, respectivamente para 'Mundo Novo', 'Icatu Amarelo', 'Acaiá Cerrado', 'Catuaí Vermelho' e 'Rubi'. Os setores embriogênicos foram isolados e diferenciados em meio de regeneração de MS a 50%, acrescido de 1,3 mM de ANA e 8,8 mM de BAP. A taxa de regeneração foi de 71,5%. Os embriões foram transferidos para maturação e germinação em meio de MS a 50%, acrescido de 1,1 mM de BAP e 2,6 mM de AIA. Após dois meses, os embriões foram transferidos para meio de crescimento em magenta, constituído do meio básico de DKW a 20%, acrescido de 1,3 mM de BAP. Com mais um a dois meses de cultivo, as plântulas foram transferidas para casa de vegetação para aclimatação.
Produção de calos embriogênicos em genótipos elite de café arábica
(2007) Santos, Ana Carolina R.; Oliveira, Paola Lidiene de; Teixeira, Joao Batista; Padilha, Lilian; Carvalho, Carlos Henrique Siqueira de; Embrapa - Café
A propagação vegetativa do cafeeiro via embriogênese somática permite a multiplicação de híbridos e de genótipos segregantes e, aplicada ao melhoramento genético, possibilita reduzir de 30 para cerca de 10 anos, o tempo necessário para o lançamento de novas cultivares. Todavia, esta metodologia de propagação ainda necessita ser otimizada para que seja possível a multiplicação de café arábica em larga escala. Este trabalho objetivou avaliar o potencial de produção de calos embriogênicos friáveis a partir de explantes foliares de 10 plantas matrizes de café arábica com resistência à ferrugem e ao bicho-mineiro e de estudar o efeito da adição de prolina (0, 200, 400, 800 e 1600 mg.L-1) na indução de calos embriogênicos. Foi também testado o efeito de 9,84 µM de BAP ou de 2iP na indução de calos embriogênicos. A percentagem de calos embriogênicos friáveis formados nos explantes foliares variou de 0 a 64,4%, sendo função da época de plaqueamento e da planta matriz utilizada. Verificou-se também que a adição de prolina ao meio de indução diminuiu a formação de calos, e que a utilização de 2ip foi mais eficiente que a de BAP para formação de calos embriogênicos friáveis.
Regeneração de embriões a partir de calo embriogênico friável do tipo HFSE de duas espécies de café (Coffea canephora, Coffea arabica)
(2001) Junqueira, Cristina Salgado; Souza, Carolina Werneck de; Teixeira, Joao Batista; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
Foram realizados experimentos com a finalidade de propor um protocolo eficiente para a regeneração de embriões somáticos de café, originados a partir de calos embriogênicos friáveis. Foi avaliada para ambas as espécies a influência de diferentes níveis de maltose (2, 4 e 6%) e 4% de sacarose e diferentes combinações de BAP/ANA, mg/L: 2,0/0,0; 2,0/0,25; 2,0/0,5; 2,0/1,0; 1,0/0,0; 2,0/0,0; e 4,0/0,0. Para a espécie de Coffea canephora, só houve regeneração no meio com diferentes níveis de açúcar, na presença de 4,0 mg/L de BAP. No entanto, para a espécie Coffea arabica, pode-se observar que o subcultivo nos tratamentos com diferentes combinações de BAP e ANA foi essencial para uma melhor resposta na regeneração. Quanto à influência dos açúcares, a melhor resposta foi obtida na presença de 4% de sacarose e 2% de maltose, principalmente para as fases globular e coração. A sincronização não foi marcante em nenhuma das espécies, embora tenha sido observada em alguns tratamentos maior freqüência de embriões na fase globular.
Regeneração de embriões somáticos de café (Coffea arabica L.) em meio líquido a partir de calos embriogênicos friáveis
(2003) Teixeira, Joao Batista; Junqueira, Cristina Salgado; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
A embriogênese somática apresenta um grande potencial para clonagem de plantas elites de café (C. arabica L.). Entretanto, para se ter uma alta eficiência no processo, bem como uma redução substancial no envolvimento de mão de obra, é necessário que a metodologia seja otimizada, sobretudo, com a utilização de meio líquido, seja em frascos convencionais sob agitação ou, preferencialmente, em biorreatores. A regeneração de embriões somáticos foi conduzida a partir da inoculação de calos embriogênicos cultivados em Erlenmeyer contendo meio líquido sob agitação e em biorreatores de imersão temporária. Os calos embriogênicos foram isolados do explante original de folha após 4 a 5 meses de cultivo e transferidos para o meio líquido de regeneração na proporção de um grama de células para um litro de meio. Foi utilizado o meio de MS, meia força, acrescido de 10 mg de tiamina, 1 mg de piridoxina, 1 mg de ácido nicotínico, 1 mg de glicina, 100 mg de mio-inositol, 100 mg de caseína hidrolisada, 400 mg de extrato de malte, por litro, e 3% de sacarose. Como reguladores de crescimento a presença de 2,0 mg/L de BAP e 0,25 mg/L de ANA foi essencial para a completa diferenciação dos embriões. Após um mês de cultivo, já era possível observar o aparecimento dos embriões globulares, em alta freqüência. Ao final do segundo mês de cultivo, praticamente apenas embriões eram observados nos frascos de cultivo. Ao final desse período, os embriões diferenciados foram transferidos para meio de maturação, quando foram avaliados os seguintes componentes: ácido abscísico (ABA) a 5,0 µM, sacarose (3,0 e 6,0%) e sorbitol (87,7 e 175,4 mM). Uma amostra dos embriões foi igualmente inoculada em meio de germinação, EG. Este meio apresentava a seguinte constituição: o meio de MS, meia força, acrescido de 10 mg de tiamina, 1 mg de piridoxina, 1 mg de ácido nicotínico, 1 mg de glicina, 100 mg de mio-inositol, por litro, e 2% de sacarose. Como reguladores de crescimento, foram adicionados BAP a 0,25 mg/L e AIA a 0,45 mg/L. Tanto na fase de diferenciação quanto na fase de maturação, foram anotados os pesos da matéria fresca inicialmente inoculada e após o cultivo por dois meses. Ao final do cultivo no meio de maturação, foi pesada uma amostra e contado o numero de embriões. A taxa de aumento no peso da matéria fresca foi calculada pela formula TCR=(lnPFf-lnPFi)/t, sendo PFf o peso da matéria fresca final, PFi o peso da matéria fresca inicial e t o tempo em dias. O tempo de dobramento da materia fresca foi calculado pela formula dt=0,693/TCR. O período de dobramento da matéria fresca foi em torno de 11 dias para a fase de diferenciação e 18,7 dias para a fase de maturação. O numero médio de embriões por grama de calo embriogênico inoculado foi de 313.000, variando de 239.827 para o tratamento com ABA a 5,0 µM a 421.217 para o tratamento com sacarose na concentração de 6%. Visualmente, os melhores tratamentos foram os com sacarose 3%, sorbitol 87,7 mM e sorbitol 175,4 mM. O meio EG conferiu igualmente um bom desenvolvimento dos embriões.