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Açúcares solúveis, sacarose sintase e sacarose fosfato sintase durante o desenvolvimento do fruto de café, sob diferentes condições de luz e carga
(2007) Geromel, Clara; Mazzafera, Paulo; Marraccini, Pierre Roger Rene; Ferreira, Lucia Pires; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Embrapa - Café
Foram abordados nesse trabalho aspectos fisiológicos de carboidratos envolvidos na relação fonte-dreno, sendo a sacarose o principal carboidrato exportado. Sabendo-se que a sacarose não é utilizada diretamente como substrato para a maioria dos processos envolvidos no crescimento, desenvolvimento e armazenamento, tanto na fonte como no dreno, o destino metabólico da sacarose é mediado pelas enzimas invertases, sacarose sintase e sacarose fosfato sintase. Nesse estudo foram dosadas as enzimas sintase da sacarose (SUSY) e sacarose fosfato sintase (SPS), assim como os teores de açúcares solúveis totais, redutores e sacarose, durante o desenvolvimento do fruto de cafeeiro em diferentes tecidos: polpa, perisperma e endosperma e em diferentes condições de tratamento: controle, onde as plantas foram expostas a pleno sol; com sombrite 50% e com carga do cafeeiro reduzida à 30%. Foi mostrado que, apesar de SUSY e SPS tenderem a ter menor atividade nos tratamentos de sol e menor produção, os teores de açúcares não variaram. Foi observado que as enzimas seguem o mesmo padrão de atividade em todos os tecidos aumentando com a maturação, independente do tratamento.
Açúcares solúveis, sacarose sintase e sacarose fosfato sintase durante o desenvolvimento do fruto de café, sob diferentes condições de luz e carga
(2005) Geromel, Clara; Mazzafera, Paulo; Marraccini, Pierre Roger Rene; Ferreira, Lucia Pires; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Pereira, Luiz Felipe Protasio; Embrapa - Café
Foram abordados nesse trabalho aspectos fisiológicos de carboidratos envolvidos na relação fonte-dreno, sendo a sacarose o principal carboidrato exportado. Sabendo-se que a sacarose não é utilizada diretamente como substrato para a maioria dos processos envolvidos no crescimento, desenvolvimento e armazenamento, tanto na fonte como no dreno, o destino metabólico da sacarose é mediado pelas enzimas invertases, sacarose sintase e sacarose fosfato sintase. Nesse estudo foram dosadas as enzimas sintase da sacarose (SUSY) e sacarose fosfato sintase (SPS), assim como os teores de açúcares solúveis totais, redutores e sacarose, durante o desenvolvimento do fruto de cafeeiro em diferentes tecidos: polpa, perisperma e endosperma e em diferentes condições de tratamento: controle, onde as plantas foram expostas a pleno sol; com sombrite 50% e com carga do cafeeiro reduzida à 30%. Foi mostrado que, apesar de SUSY e SPS tenderem a ter menor atividade nos tratamentos de sol e menor produção, os teores de açúcares não variaram. Foi observado que as enzimas seguem o mesmo padrão de atividade em todos os tecidos aumentando com a maturação, independente do tratamento.
Análise de genes expressos durante estádios finais da maturação de frutos de café
(2005) Budzinski, Ilara G. F.; Cação, Sandra M. B.; Carneiro, Cristine E.A.; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Embrapa - Café
A maturação uniforme dos frutos do cafeeiro relaciona-se diretamente com a qualidade da bebida. Diferentes floradas em um mesmo cafeeiro propiciam frutos em estádios desiguais de maturação podendo resultar em uma maior dificuldade na colheita, maior gasto com mão de obra e queda na qualidade do produto. Em frutos climatéricos, o processo final da maturação é desencadeado por um grande acúmulo de etileno, seguido por mudança bioquímicas e fisiológicas que promovem principalmente a desestabilização da parede celular dos frutos, composta principalmente por compostos pécticos. As pectinas são degradadas devido à solubilização e despolimerização da parede celular vegetal em decorrência da ação de enzimas como: pectinametilesterase, poligalacturonase, xiloglucanases, xilanases, pectinaliases e [Beta]-galactosidases. Nosso objetivo principal é caracterizar e entender as mudanças na expressão gênica e enzimática que ocorrem durante a maturação dos frutos de café, visando melhorar a uniformidade da maturação. Neste trabalho foram feitos estudos de expressão de genes que codificam para ACC oxidase, expansina, pectinametilesterase e poligalacturonases, através da análise "in silico" do banco de dados do Projeto Genoma Café, e experimentos de expressão dos genes e enzimas. Análise de transcritos demonstrou um aumento de ACC oxidase em frutos verde-cana seguido da atividade de pectinametilesterases em estágios intermediários de maturação (frutos avermelhados). A atividade da PG foi detectada nos estádios finais de maturação, principalmente em frutos cereja.
ANÁLISE IN SILICO DE GENES ENVOLVIDOS NO TRANSPORTE DE NITRATO, AMÔNIO E URÉIA EM CAFEEIRO
(2009) Meda, Anderson Rotter; Pereira, Luiz Felipe Protasio; Santos, Tiago Benedito dos; Caramori, Paulo; Pavan, Marcos Antonio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Embrapa - Café
O nitrogênio (N) é o nutriente mais requerido pelo cafeeiro, sendo adquirido principalmente pelas raízes. As formas de N mais abundantes em solos agrícolas são nitrato (NO 3 -) e amônio (NH 4 +), enquanto que a uréia [CO(NH) 2 ] é a principal forma de N utilizada na adubação do cafeeiro. Devido a participação significativa da adubação nitrogenada nos custos de produção do café, é de interesse a identificação de genes envolvidos na absorção radicular e translocação de nitrogênio no cafeeiro, visando uma otimização da eficiência do uso do nitrogênio pela cultura. Neste trabalho foram encontradas etiquetas de sequências expressas (ESTs) no banco de dados do Projeto Genoma Café relacionadas ao transporte das formas mais relevantes na aquisição do N. O número de contigs/singlets para as diferentes famílias de transportadores decresceu na ordem: nitrato (NRT) > amônio (AMT) > uréia (DUR3). A maior expressão e diversidade de transportadores de nitrato refletem a importância desta forma de N na nutrição e fisiologia do cafeeiro, assim como na maioria das outras espécies de plantas.
Análise in silico de pectinametilesterases de Coffea spp.
(2007) Leite, Thiago Falda; Budzinski, Ilara G. F.; Cação, Sandra Maria Bellodi; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Embrapa - Café
A maturação desuniforme dos frutos do cafeeiro, associada a práticas inadequadas de colheita e pós-colheita, pode prejudicar a qualidade final do café. Visando compreender melhor os genes envolvidos na maturação de frutos do cafeeiro foram iniciados estudos in silico e in vivo da atividade da pectinametilesterase (PME-EC 3.2.1.11). A PME é a enzima responsável por catalisar a desmetilação de ésteres metílicos dos ácidos poligalacturônicos e se encontra distribuída em raízes, caules, folhas e frutos da grande maioria das plantas superiores. Essa enzima tem um importante papel no amaciamento de frutos pelo aumento da susceptibilidade das pectinas a poligalacturonase (PG) durante o amadurecimento. A análise in silico foi realizada através de buscas no banco de dados disponibilizados pelo projeto Genoma Café, assim como de outros bancos de domínio público. Foram identificados inicialmente 31 contigs, mas apenas oito destes apresentavam seqüências provenientes de bibliotecas de frutos de café. Comparação dos contigs obtidos nos bancos de dados do Genoma Café e do HarvEST Coffea, permitiu a caracterização in silico da expressão de alguns dos contigs nos diferentes estágios de maturação dos frutos. Análise da expressão in vivo destes contigs está sendo realizada para validação dos dados obtidos in silico.
Análise in silico e in vivo da via de isoprenóides em café
(2007) Tiski, Iris; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Pot, David; Marraccini, Pierre Roger Rene; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Embrapa - Café
Os diterpenos cafestol e caveol, presentes na fração lipídica em grãos de café, originam-se da via de síntese de isoprenóides. Estes compostos são sintetizados em todos os organismos, sendo abundantes em plantas com cerca de 10 mil componentes relatados. Apesar da diversidade de funções e estruturas todos os isoprenóides derivam de cinco comuns átomos de carbono, o isopentenil difosfato (IPP) e do isômero dimetilalil difosfato (DMAPP). Em vegetais superiores, duas vias localizadas em compartimentos intracelulares separados estão envolvidas na biossíntese de IPP e DMAPP. No citosol, IPP é derivado da via do ácido mevalônico (MVA) e no plastídeo, IPP é formado pela via do metileritritol fosfato (MEP ou não mevalonato). Com a disponibilidade das seqüências dos genes expressos (ESTs) pelo Projeto Genoma Café tornou-se possível a identificação in silico e o estudo funcional dos genes que codificam para as enzimas 3-hidroxi-3metilglutaril-CoA reductoisomerase (HMGR) e mevalonato difosfato decarboxilase (MPDC) para a via MVA e 1-deoxi-D-xilulose 5-fosfato reductoisomerase (DXR) e isopentenil difosfato sintase (IDS) para a via MEP. Foram obtidas 13 ESTs de HMGR, que originaram três contigs incompletos, resultando em duas isoformas. Para o gene MPDC foram encontradas 7 ESTs que clusterizaram em somente uma isoforma, diferentemente de A. thaliana onde duas isoformas são encontradas. Para os genes da via MEP foram encontrados 22 ESTs para DXR e 47 ESTs para IDS que formaram apenas um contig para cada um destes genes. Southern blots dos genes HMGR e DXR também demonstraram a presença de duas isoformas para HMGR e uma para DXR em C. arabica. Análise da expressão por Northern blots detectou transcritos do gene DXR no começo de desenvolvimento do perisperma e nas fases finais de desenvolvimento de endosperma e polpa. Transcritos da isoforma HMGR2 foram detectados em polpa, perisperma e endosperma, em todas as fases de desenvolvimento do fruto. Entretanto, HMGR1 apresentou transcritos apenas em polpa e fase inicial do desenvolvimento de perisperma e endosperma.
Análise proteômica do estresse hídrico em cafeeiro
(2007) Ramos, Humberto J.O.; Chaves, Daniela F.S.; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Cruz, Leonardo M.; Fungaro, Maria H.; Hungria, Mariângela; Osaku, Clarice; Petzl-Erler, Maria L.; Ayub, Ricardo Antônio; Peralta, Rosane M.; Marur, Celso Jamil; Souza, Emanuel M.; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Pedrosa, Fábio O.; Embrapa - Café
Déficit hídrico é um dos fatores ambientais mais importantes para a diminuição da produtividade do cafeeiro, tanto no Brasil quanto em outros países produtores. O estabelecimento de estratégias para obtenção de cultivares tolerantes ao estresse hídrico depende da compreensão das respostas biológicas ao nível genético, molecular e bioquímico. Para estudar a resposta ao estresse hídrico no gênero Coffea, foi estabelecida uma rede de pesquisa em proteômica (PROTEOPAR - Programa Proteoma do Paraná) constituída de oito laboratórios. Quatro genótipos de Coffea, com diferentes respostas fisiológicas à seca, foram analisados: C. canephora (Clone 14, tolerante e Clone 109A, sensível) e C. arabica (BA10, tolerante e Geisha, sensível). Proteínas foram extraídas de folhas e raízes de plantas (18 meses de idade) mantidas em casa-de-vegetação, utilizando-se o método de SDS-Fenol modificado. Os regimes hídricos constituíram-se dos seguintes tratamentos: controle irrigado, estresse hídrico severo (-4,0 MPa de potencial de água) e recuperação pós-estresse (36 horas após irrigação). Os extratos protéicos foram distribuídos aos laboratórios do PROTEOPAR para obtenção e análise do padrão de expressão protéica diferencial via eletroforese bidimensional. O método de identificação de proteínas PMF ("Peptide mass fingerprinting") foi aplicado utilizando-se um espectrômetro de massa (MS) do tipo MALDI-TOF e comparando os espectros de digestão tríptica contra bancos de dados baseados em ESTs de Coffea.
Caracterização in silico de genes de expansina presentes em cafeeiro (Coffea arabica L.)
(2007) Budzinski, Ilara G. F.; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Embrapa - Café
As expansinas (EXPs) são proteínas que promovem o relaxamento e extensão da parede celular em plantas, sendo codificadas por uma multifamília gênica e classificadas em: [alfa]-expansinas, [beta]-expansinas, expansin-like A (EXLA) e expansin-like B (EXLB). Estas proteínas atuam no alongamento celular, maciez dos frutos, abscisão, germinação e polinização. As [alfa]-expansinas representam a maior família e relacionam-se diretamente com o controle da extensão da parede celular em processos de desenvolvimento. Visto que a maturação uniforme dos frutos de café contribui para a qualidade da bebida, este trabalho teve por objetivo identificar e caracterizar in silico genes de expansinas envolvidas neste processo. Através da mineração dos dados do Genoma Café foram encontrados 28 contigs referentes às EXPs, sendo dois contigs de EXLB, um de EXLA e os demais pertencentes à família das [alfa]-expansinas. Dentro desta ultima família foram identificados quatro contigs relacionados com o desenvolvimento dos frutos do cafeeiro. Comparação dos contigs obtidos nos bancos do Projeto Genoma Café e de contigs no banco de dados HarvEST Coffea permitiu a caracterização in silico da expressão dos contigs nos diferentes estádios de maturação dos frutos.
Caracterização nutricional de acessos provenientes da Etiópia de café arábica
(Editora UFLA, 2015-01) Santos, Tiago Benedito dos; Meda, Anderson Rotter; Sitta, Renata Barrufaldi; Vespero, Eduardo Brandalize; Pavan, Marcos Antonio; Charmetant, Pierre; Carpentieri- Pípolo, Valéria; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Domingues, Douglas Silva
Devido à necessidade cada vez maior de cultivares que apresentem boa produtividade com impactos menores ao meio ambiente, a introgressão de características relacionadas ao uso eficiente de nutrientes minerais é uma estratégia relevante para o melhoramento genético do café. Nesse sentido, a caracterização de acessos provenientes do centro de origem da espécie é um importante subsídio para os programas de melhoramento visando à seleção de materiais de interesse para produção de novas cultivares. Objetivou-se,no presente trabalho, caracterizar a concentração de nove nutrientes minerais em 12 acessos de Coffea arabica L., provenientes da Etiópia, em casa de vegetação, visando identificar genótipos com acumulação diferencial de nutrientes minerais em folhas, caule e raízes. Com base nos parâmetros estabelecidos, o acesso E237/CAF032 apresentou acúmulo diferencial para P, em folhas e E565/CAF009, E386/CAF131 e E332/CAF023 apresentaram concentração diferencial de N, Zn e Mn em raízes, respectivamente. O presente trabalho selecionou um acesso com potencial eficiência para uso de P e outro com potencial eficiência para o uso de N, o que pode contribuir em futuros estudos de seleção de materiais que possam ser utilizados na introgressão de características relacionadas à eficiência nutricional.
CONCENTRAÇÃO DE NUTRIENTES MINERAIS EM ACESSOS DA ETIÓPIA DE Coffea arabica
(2011) Santos, Tiago Benedito dos; Meda, Anderson Rotter; Sitta, Renata Barrufaldi; Vespero, Eduardo Brandalize; Pavan, Marcos Antonio; Charmetant, Pierre; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Domingues, Douglas Silva; Embrapa - Café
O sucesso do manejo nutricional em plantas depende de diversos fatores, como características químicas, biológicas e físicas do solo, além da influência do genótipo. Apesar do manejo agronômico visando à adequação do solo para a cultura do cafeeiro estar bem estabelecido, pouco se sabe sobre o efeito do genótipo na absorção e acúmulo de nutrientes minerais. Tradicionalmente, o melhoramento genético do cafeeiro foca-se em características morfológicas, resistência a doenças e na produtividade; dessa forma, a exigência nutricional foi deixada em plano secundário ao longo deste processo. Com a necessidade cada vez maior de variedades que apresentem boa produtividade com impactos menores ao meio ambiente, a introgressão de características de genótipos silvestres é uma relevante estratégia para incremento da eficiência nutricional. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo caracterizar a concentração de nutrientes em 12 acessos silvestres de Coffea arabica provenientes da Etiópia, identificando genótipos de cafeeiro que apresentam acumulação diferencial de nutrientes minerais (N, P, K, Ca, Mg, Cu, Zn, B e Mn) com relação a três tecidos: folhas, caule e raiz. Entre os acessos da Etiópia, destacou-se a concentração diferencial de P em folhas do acesso CAF032, e o acúmulo em raiz de N (CAF009), Zn (CAF131) e Mn (CAF023). Bourbon teve acúmulo diferencialmente menor de P no caule e maior de Ca na raiz e Catuaí Vermelho apresentou concentração diferencial de Mg no caule. O presente trabalho é uma importante contribuição na definição de genótipos silvestres de Coffea arabica com potencial de introgressão de características relacionadas à eficiência nutricional.
Construção de uma biblioteca genômica de cromossomo artificial de bactéria de Coffea arabica
(2007) Cação, Sandra Maria Bellodi; Diniz, Leandro Eugenio Cardamone; Silva, Nathalia V.; Veniky, Filipe; Andrade, Alan Carvalho; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Embrapa - Café
A produção de mapas físicos em plantas tem grande importância para estudos de genética e melhoramento. O passo inicial para produção destes mapas é a construção de bibliotecas genômicas com largos fragmentos de DNA, em vetores do tipo cromossomo artificial de bactéria (BAC) ou de levedura (YAC). Visando a produção de um mapa físico, o objetivo deste trabalho foi construir uma biblioteca genômica de BAC de café. Fragmentos de DNA de alto peso molecular de C. arabica híbrido de Timor cv. 832/2 foram clonados no vetor pCC1BAC e transformados em E. coli DH10B. Após transformação 57000 clones foram inicialmente obtidos e ordenados manualmente em placas de 96 poços. A biblioteca foi transferida em triplicata para placas de 384 poços, com equipamento Q-BOT, resultando em 55.778 clones em 148 placas. A verificação do tamanho do inserto de 130 clones revelou tamanho médio de 115-120 Kb. A cobertura do genoma haplóide estimada para C.arabica foi de cinco vezes. A validação da biblioteca presença de DNA de cloroplasto e mitocôndria, assim como a seleção inicial com sondas para iniciar o mapeamento físico, está sendo realizada através de hibridização de colônias em membranas contendo 18.462 clones em duplicata.
Diversidade nucleotídica de genes envolvidos na biossíntese de ácidos clorogênicos de cafeeiros
(Editora UFLA, 2013-04) Ivamoto, Suzana Tiemi; Pot, David; Lannes, Sergio Dias; Domingues, Douglas Silva; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Pereira, Luiz Filipe Protasio
Os ácidos clorogênicos (CGAs) são compostos químicos importantes de Coffea spp. para a qualidade da bebida, pois eles interferem na adstringência e podem alterar o aroma e sabor da bebida. Aproximadamente 310.000 ESTs de Coffea estão disponíveis e possibilitam o acesso à variabilidade nucleotídica da planta e o desenvolvimento de marcadores moleculares ligados à qualidade da bebida para as principais enzimas da via de biossíntese dos CGAs: PAL, C4H, 4CL, CQT e C3’H. Neste trabalho foram detectados polimorfismos dos tipos SNP, INDEL ou SSR dentro das sequências nucleotídidicas disponíveis no Protejo Genoma Café e no NCBI. As sequências de ESTs de CGAs foram clusterizadas pelo programa Codon Code Aligner, assim como a detecção de polimorfismos e validação dos mesmos (qualidade de cromatograma). Foram identificadas seis isoformas para PAL, uma para C4H, seis para 4CL, duas para CQT e duas para C3’H. Os contigs formados apresentaram um total de 248 polimorfismos (236 SNPs e 12 INDELs), sendo 201 na região codante (127 não sinônimos e 74 sinônimos). A frequência dos polimorfismos foi maior nas regiões UTRs (1pol/54pb), em relação à codante (1pol/81pb). A análise das sequências de C. arabica permitiu a identificação de 2 subgrupos diferentes de sequências, referentes aos seus genomas ancestrais (C. canephora e C. eugenioides). Foi observada a presença de 67,4% dos polimorfismos entre os grupos ancestrais e 32,6% dentro dos grupos em C. arabica. Esses resultados vêm permitindo definir genes tanto para estudos de expressão de homeólogos de CGAs como para o desenvolvimento de marcadores moleculares para o mapeamento genético.
ESTRESSE HÍDRICO ALTERA O PERFIL DE EXPRESSÃO DE ISOFORMAS DA SUBUNIDADE MENOR (RBCS) DA RUBISCO EM FOLHAS DE Coffea arabica E Coffea canephora
(2009) Alves, Gabriel Sergio Costa; Ramos, Humberto; Rodrigues, Gustavo Costa; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Marraccini, Pierre; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
A ampliação do conhecimento sobre os determinantes moleculares e genéticos da tolerância à seca no cafeeiro, com vistas a possibilitar a identificação de marcadores ligados à tolerância ao estresse hídrico é uma etapa essencial para o estabelecimento de um programa de melhoramento genético do cafeeiro, por seleção assistida. Aqui apresentamos resultados preliminares sobre os efeitos do estresse hídrico na expressão do gene RBCS codificando para a pequena subunidade (RBCS) da enzima Ribulose Di-fosfato Carboxilase (RUBISCO). Uma análise dos dados do projeto Genoma Café, possibilitou a identificação de diferentes contigs codificando para essa enzima. Primers específicos para esses contigs foram desenhados e os resultados das reações de qPCR realizadas, mostraram que a expressão do gene correspondente é altamente reduzida em folhas de C. canephora e C. arabica submetidas ao estresse hídrico. Por outro lado, uma comparação dos perfis protéicos (2DE) demonstraram que a expressão total da RBCS aumenta em resposta ao estresse hídrico e que novas isoformas dessa enzima foram observadas especificamente, em condições de déficit hídrico. Esses resultados indicam que o estresse hídrico afeta a expressão de genes importantes para a atividade fotossintética em plantas de café e que a expressão de formas alélicas diferentese/ou modificações pós- traducionais da RBCS, podem representar uma resposta adaptativa do cafeeiro à restrição hídrica.
EXPRESSÃO DO GENE RBCS1 EM CAFÉ: COFFEA ORTÓLOGOS, COFFEA ARABICA HOMEÓLOGOS E VARIABILIDADE DE EXPRESSÃO ENTRE GENOTIPOS E SOB ESTRESSE HIDRICO
(2011) Vieira, Natália Gomes; Freire, Luciana Gomes; Alves, Gabriel Sérgio Costa; Vinecky, Felipe; Elbelt, Sonia; Ramos, Humberto Josué de Oliveira; Montagnon, Christophe; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Leroy, Thierry; Pot, David; Silva, Vânia Aparecida; Rodrigues, Gustavo Costa; Marraccini, Pierre; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
A expressão do gene RBCS1 foi analisada no contexto da alopoliploidia de C. arabica. O nosso estudo revelou a existência de dois genes RBCS1 homeólogos em C. arabica: um oriundo do sub-genoma de C. canephora (chamado CaCc) e o outro oriundo do sub-genoma de C. eugenioides (chamado CaCe). Usando primers específicos de cada homeólogos, os estudos da expressão revelaram que CaCe se expressava em C. eugenioides e C. arabica mas nao em C. canephora. Por outro lado, CaCc se expressava em C. canephora mas estava quase silenciado em genótipos não- introgredidos (“puros”) de C. arabica. Entretanto, uma expressão de CaCc foi observada na maioria dos cultivares de C. arabica introgredidos com genoma de C. canephora. Para ambas as espécies, o estresse hídrico levou a uma diminuição importante na abundância dos transcritos RBCS1. Isto foi observado para as plantas cultivadas na casa de vegetação ou no campo sob um estresse severo ou moderado.
Expressão gênica em larga escala de raizes de Coffea arabica L.
(Embrapa Café, 2015) Santos, Tiago Benedito dos; Silva, Juliana Costa; Soares, João Danillo Moura; Baba, Viviane Yumi; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Domingues, Douglas Silva
A utilização de novas tecnologias de sequenciamento em larga escala (454-mRNAseq) é uma frente inovadora de estudos para a biotecnologia do cafeeiro, promovendo a identificação e caracterização de novos componentes genômicos de interesse. Mudas de cafeeiro foram mantidas sob supressão de fontes nitrogenadas e suas raízes foram utilizadas para construção de bibliotecas de cDNA, que foram sequenciados utilizando a plataforma GS-FLX Titanium da Roche. Foram gerados um total 809.517 reads, os quais geraram 34.654 contigs. Por meio dos transcritos gerados pelo mRNAseq de raiz espera-se identificar e caracterizar molecularmente os genes envolvidos no transporte e metabolismo de nitrogênio no cafeeiro.
Galactinol synthase transcriptional profile in two genotypes of Coffea canephora with contrasting tolerance to drought
(Sociedade Brasileira de Genética, 2015) Santos, Tiago Benedito Dos; Lima, Rogério Barbosa de; Nagashima, Getúlio Takashi; Petkowicz, Carmen Lucia de Oliveira; Carpentieri-Pípolo, Valéria; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Domingues, Douglas Silva; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves
Increased synthesis of galactinol and raffinose family oligosaccharides (RFOs) has been reported in vegetative tissues in response to a range of abiotic stresses. In this work, we evaluated the transcriptional profile of a Coffea canephora galactinol synthase gene (CcGolS1) in two clones that differed in tolerance to water deficit in order to assess the contribution of this gene to drought tolerance. The expression of CcGolS1 in leaves was differentially regulated by water deficit, depending on the intensity of stress and the genotype. In clone 109A (drought-susceptible), the abundance of CcGolS1 transcripts decreased upon exposure to drought, reaching minimum values during recovery from severe water deficit and stress. In contrast, CcGolS1 gene expression in clone 14 (drought-tolerant) was stimulated by water deficit. Changes in galactinol and RFO content did not correlate with variation in the steady-state transcript level. However, the magnitude of increase in RFO accumulation was higher in the tolerant cultivar, mainly under severe water deficit. The finding that the drought-tolerant coffee clone showed enhanced accumulation of CcGolS1 transcripts and RFOs under water deficit suggests the possibility of using this gene to improve drought tolerance in this important crop.
IDENTIFICAÇÃO DE CLONES BAC COM MARCADORES MOLECULARES VISANDO A INTEGRAÇÃO DE MAPAS FÍSICOS E GENÉTICOS
(2011) Cação, Sandra Maria Bellodi; Silva, Nathalia Volpi e; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Embrapa - Café
Bibliotecas BAC (Cromossomo Artificial de Bactéria) têm sido muito utilizadas para suporte de trabalhos de mapeamento físico, clonagem posicional, mapeamento comparativo e estudos de evolução de genomas. Visando realizar o mapeamento físico em Coffea arabica, iniciamos a identificação e caracterização de clones BAC de uma biblioteca de C. arabica hibrido timor 832/2. A biblioteca contém 56.832 clones BACs com tamanho médio de 120 Kb, representando uma cobertura de 5,5 vezes o tamanho do genoma do C. arabica. Os clones da biblioteca BAC foram inicialmente agrupados em pools de placa com 384 clones, e superpools contendo 15 pools de placa o que representa 5.760 clones. A identificação do BAC de interesse foi realizada através da seleção por PCR nos superpools e pools, seguida por hibridização em filtros de colônia contendo 384 clones. Para a seleção dos superpools e pools de placas foram utilizados os primers baseados em AFLPs relacionados com lócus de resistência à ferrugem (M-8, SAT-244 e BA-124). Também foram utilizados os marcadores SSR-18 (GL1), SSR-16 (GL2), ACGG-1 (GL3), CCG-3 (GL6), de quatro grupos de ligação do mapa genético parcial de C. arabica (Oliveira et al, 2007) visando identificar e posicionar BAC para cada grupo de ligação. Os BAC selecionados nas hibridizações foram confirmados através de extração individual do clones, seguida por PCR para checar a marca de interesse. Até o momento foram identificados 32 clones BAC para as marcas de resistência a ferrugem e 98 para os 4 grupos de ligação. Os BAC selecionados serão sequenciados para o mapeamento físico da região contendo lócus de resistência à ferrugem.
IDENTIFICAÇÃO DE GENES COM EXPRESSÃO DIFERENCIAL EM FOLHAS DE CAFEEIRO Coffea canephora E Coffea arabica SUBMETIDAS À DIFERENTES CONDIÇÕES DE ESTRESSE HÍDRICO
(2009) Marraccini, Pierre; Alves, Gabriel Sergio Costa; Vinecky, Felipe; Freire, Luciana Pereira; Vieira, Natalia Gomes; Ramos, Humberto J. O.; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Elbelt, Sonia; Marques, Thomas; Rodrigues, Gustavo Costa; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
Com a perspectiva de se estabelecer um programa de melhoramento genético por seleção assistida para a tolerância à seca em cafeeiro, o presente trabalho objetivou a identificação de genes candidatos para esta característica, por meio de análises integradas dos perfis de expressão gênica e protéico. Os resultados foram obtidos a partir de análises comparativas da expressão gênica e protéica de diferentes materiais genéticos (Tolerante vs. Sensível) assim como, diferentes regimes hídricos (Controle vs. Estresse hídrico). Os materiais genéticos estudados neste trabalho foram os clones de conillon 22 e 14 (Coffea canephora) e os cultivares Rubi e Iapar 59 (Coffea arabica). O estresse hídrico (Ψ PD =-3,0 MPa) aplicado às plantas de conillon foi obtido em casa de vegetação e no caso de Arabica, foram avaliadas plantas adultas em condições de campo, sendo as folhas colhidas nos períodos diurno e noturno, onde o maior estresse hídrico observado foi de Ψ PD =-1,7 MPa. Após a seleção dos genes candidatos por meio de diferentes estratégias, a expressão diferencial foi validada por qPCR. Os resultados mostram que muitos genes apresentaram uma queda de expressão com o estresse hídrico e esses genes, em geral, codificam proteínas implicadas na fotossíntese. Por outro lado, o estresse hídrico em cafeeiro, também induz a expressão de vários genes já descritos na literatura como essênciais à resposta das plantas à limitação de água, tais como RD29, DREBA e NAC, por exemplo. Já no caso de um gene que codifica para uma dehidrina, os resultados obtidos neste trabalho, permitiram confirmar as expressões diferenciais previamente observadas em C. canephora, também em C. arabica. Contudo, este estudo revelou a importância de outros fatores no controle da expressão desses genes, tais como os ritmos circadianos (ciclos noite/dia), a idade e o “histórico” das plantas, sendo que estas obervações, tornam ainda mais complexa, a interpretação dos dados de expressão diferencial, quando se utiliza material vegetal cultivado em condições de campo.
Identificação de genótipos de cafeeiro de importância comercial pela técnica PCR-RAPD
(2001) Nunes, Liliane Moreira; Molinari, Hugo Bruno; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Crochemore, Maria Lúcia; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
Classicamente, a identificação de cultivares do cafeeiro utiliza descritores morfológicos da semente e da planta em crescimento. A utilização de marcadores moleculares, além de permitir uma identificação genética precisa, possibilita a caracterização dos genótipos com menor custo de mão-de-obra e de tempo, pois a descrição é realizada com pequenas quantidades de DNA genômico, extraído em qualquer etapa de crescimento da planta. Este estudo tratou da identificação de genótipos de Coffea arabica de interesse comercial em diferentes regiões produtoras de café, utilizando-se marcadores do tipo PCR-RAPD. Foi realizado um "screening" com 140 primers, sendo selecionados 56. Dentre estes, até o momento, cinco deles apresentaram 23 bandas polimórficas com reprodutibilidade. Análise em Componentes Principais (ACP) e o cálculo de distâncias entre os genótipos mostraram certa divergência e indicaram um background genético de Coffea canephora em vários genótipos analisados. Os resultados até agora obtidos não mostram polimorfismo suficiente para a caracterização entre variedades dentro da espécie Coffea arabica.
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE CLONES BAC DE COFFEA ARABICA L. HT 832/2 COM MARCAS PARA RESISTÊNCIA À FERRUGEM
(2009) Cação, Sandra Maria Bellodi; Silva, Nathalia Volpi e; Pereira, Lídia Francisca; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Pereira, Luiz Felipe Protasio; Embrapa - Café
Bibliotecas BAC (Cromossomo Artificial de Bactéria) têm sido muito utilizadas em mapeamento físico, clonagem posicional, mapeamento comparativo e estudos de evolução de genomas. Visando realizar o mapeamento físico em C. arabica, iniciamos a identificação e caracterização de clones BAC de uma biblioteca de C. arabica hibrido timor 832/2. O híbrido timor, derivado de um cruzamento interespecífico natural provavelmente entre Coffea arabica L. cultivar típica e Coffea canephora, apresenta características de importância agronômica como resistência a diversas raças do fungo biotrófico Hemileia vastatrix. A biblioteca contém 55.000 clones BACs com tamanho médio de 120 Kb. Os clones da biblioteca BAC foram inicialmente agrupados em pools de placa , com 384 clones, e superpools contendo 15 pools de placa o que representa 5760 clones. A identificação de BACs de interesse foi realizada através da seleção por PCR nos superpools e pools, seguida por hibridização em filtros de colônia de bactéria contendo 384 clones. Os superpools e pools de placas submetidos à seleção por PCR utilizaram os primers baseados em AFLPs relacionados com lócus de resistência à ferrugem (BA-48, BA-124). O superpool 07 foi positivo para o marcador BA-48 e os superpools 03, 04, 07 e 08 para o marcador BA-124. Estes superpools foram desmembrados em pools de placa e as placas positivas plotadas em membranas para hibridização com sondas específicas. Os BACs selecionados nas hibridizações foram confirmados através de extração individual do clones, seguida por PCR para verificação da marca de interesse. Até o momento foram identificados 68 clones BACs para o marcador BA-48 e 85 clones para o marcador BA-124. Os BACs selecionados estão sendo parcialmente sequenciados para o mapeamento físico da região contendo lócus de resistência à ferrugem.