UFV - Dissertações

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Caracterização de uma região genômica do híbrido de timor CIFC 832/2 associada à resistência à Hemileia vastatrix
(Universidade Federal de Viçosa, 2019-07-31) Alves, Danúbia Rodrigues; Caixeta, Eveline Teixeira; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Almeida, Dênia Pires de
A ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix é a principal doença de importância econômica dessa cultura, sendo responsável por grandes prejuízos à cafeicultura mundial. Novas raças do patógeno têm surgido infectando cultivares de café comercializados como resistentes a essa doença. Desse modo, devido ao alto potencial adaptativo do fungo, a busca por cafeeiros resistentes a essa doença é uma atividade recorrente nos programas de melhoramento. Estudos com o Híbrido de Timor (HdT), tem sido realizados em pesquisas que visam resistência durável à ferrugem e outras doenças do cafeeiro. Compreender a natureza da resistência duradoura em genótipos do HdT e descrever os genes envolvidos na defesa das plantas é fundamental para o uso eficiente dos recursos disponíveis nesse híbrido natural. A utilização de ferramentas moleculares e de bioinformática tem mostrado resultados significativos para a ampliação do conhecimento dos genes envolvidos no patossistema Coffea - H. vastatrix. Desse modo, objetivou-se com esse estudo sequenciar e caracterizar, por meio de análises de bioinformática, uma região do genoma do Híbrido de Timor CIFC 832/2, que contém marcadores associados à resistência à H. vastatrix. Para isso foi realizado o sequenciamento do clone BAC 70-22F contendo a marca funcional de resistência, por meio da Plataforma Illumina MiSeq (paired – end reads). Posteriormente foi feita a montagem dos contigs e a predição dos genes. Realizou-se a anotação gênica com base nos genomas de Coffea arabica, Coffea canephora e Coffea eugenioides, utilizando a ferramenta BLAST. A anotação gênica revelou a presença de genes candidatos relacionados ao mecanismo de resistência de hospedeiros contra patógenos. Foram anotados 991 genes do clone BAC 70-22F. Desses genes, 340 foram anotados com similaridade com o genoma de C. arabica (var. Caturra), 337 com o genoma de C. eugenioides e 314 com o genoma de C. canephora (clone IF 200). Com base na anotação gênica foram selecionadas duas sequências de genes candidatos a receptores like kinases (RLK) e desenhados primers para estudo do perfil de expressão gênica durante a interação Coffea - H. vastatrix. Um possível gene de resistência, LRR receptor-like serine/threonine-protein kinase GSO2, foi descrito e apresentou um perfil de expressão correspondente a uma resposta de resistência pré-haustorial. O outro possível receptor like kinase em estudo, apresentando um domínio LRR, exibiu uma diminuição na expressão gênica pré-haustorial em genótipos incompatíveis. As análises filogenéticas desses genes, bem como os estudos de identidade e similaridade genética da região genômica clonada, demonstraram uma relação mais próxima entre o clone BAC 70-22F e a espécie C. arabica e corroboram com a diversidade genética descrita para o HdT. Os resultados sugerem que a região genômica clonada do HdT CIFC 832/2 possui importantes genes candidatos a resistência do cafeeiro à H. vastatrix e apresentam informações relevantes para ampliar o conhecimento sobre o HdT, podendo contribuir para futuros planejamentos de estratégias de melhoramento do cafeeiro.
Caracterização molecular e fenotípica de populações de Coffea arabica em seleção recorrente
(Universidade Federal de Viçosa, 2020-03-24) Silva, Ana Carolina Andrade; Caixeta, Eveline Teixeira; Almeida, Dênia Pires de
Os principais problemas fitossanitários nas lavouras de café arábica são a ferrugem causada pelo fungo Hemileia vastatrix e Coffee Berry Disease (CBD) causada pelo fungo Colletotrichum kahawae, sendo uns dos principais responsáveis pela redução da produtividade do cafeeiro e qualidade de bebida. Uma forma socioambiental eficiente para o controle dessas doenças é o uso de cultivares resistentes obtidas por meio de melhoramento genético. No entanto, o melhoramento genético do cafeeiro é um processo demorado, que pode levar cerca de 25 anos para se obter uma nova cultivar. Nesse sentido, a utilização de métodos de melhoramento associados a marcadores moleculares é uma alternativa viável para acelerar o processo de desenvolvimento de novas cultivares de café. Uma das aplicações de extrema relevância dos marcadores moleculares no melhoramento genético de plantas consiste em sua utilização como ferramenta auxiliar nos procedimentos de seleção assistida por marcadores moleculares (SAM). A SAM no processo de piramidação de alelos de resistência a doenças é amplamente eficiente, uma vez que permite a seleção na ausência do patógeno, anula o efeito do ambiente, de pleiotropia e epistasia e permite a eliminação dos genótipos indesejáveis nas primeiras gerações de seleção. Desse modo, o objetivo do presente estudo foi implementar a seleção assistida no melhoramento de duas populações de C. arabica, C6T-10 e C6T-24, em geração F 2 de seleção recorrente. Estudo da diversidade genética e análises morfoagronômicas dessas populações também foram realizadas para auxiliar na seleção dos cafeeiros. Para tanto, DNA de 148 cafeeiros pertencente às duas populações foi extraído e amplificado com marcadores moleculares associados a genes de resistência a ferrugem e ao CBD, bem como marcadores microssatélites distribuídos aleatoriamente no genoma. Para resistência a ferrugem foram utilizados marcadores ligados a três locos, sendo dois QTL que correspondem a genes maiores de resistência as raças I, II e patótipo 001 de H. vastatrix e um gene RGA (Disease Resistance Gene Analogs). Para CBD foram utilizados dois marcadores que se encontram flanqueando o gene Ck-1. Os marcadores microssatélites foram usados para o estudo de diversidade genética. Os dados dos marcadores associados aos dois QTL sugerem que todos cafeeiro da população C6T-24 possuem resistência para as raças I, II e patótipo 001 de H. vastatrix, pois a presença de um alelo dominante em um dos dois locos é suficiente para que o indivíduo seja resistente. O gene RGA associado a resistência a esse patógeno foi identificado em 117 cafeeiros. Para resistência a C. kahawae, 46 cafeeiros da população C6T-10 e 59 da população C6T-24 apresentaram o gene Ck-1. Foram identificados 37 cafeeiros da população C6T-10 e 23 da população C6T-24 com a piramidação dos quatro locos de resistência a H. vastatrix e C. kahawae. Esses mesmos cafeeiros foram avaliados como resistentes à ferrugem em nível de campo no ano de 2019. Outras características morfoagronômicas foram analisadas, permitindo a seleção de genótipos contendo piramidação de genes de resistência e características de interesse agronômico. Para auxiliar na seleção de genótipos a serem cruzado para formar novo ciclo de retrocruzamento, foi realizado estudo da diversidade dos cafeeiros, usando a análise de agrupamento UPGMA. Observou-se a formação de quatro grupos principais, permitindo evidenciar a diversidade dentro da população C6T-10. Com base nesse trabalho, foi possível selecionar cafeeiros em geração F 2 contendo a piramidação de alelos de resistência a H. vastatrix e C kahawae, bem como genótipos contendo diversidade que podem ser usados para cruzamento e formação de nova população para seleção recorrente. Palavras-chave: Melhoramento do cafeeiro. SAM. Diversidade genética. Piramidação de genes. Hemileia vastatrix. Colletotrichum kahawae.
Desenvolvimento e utilização de marcadores moleculares para seleção de cafeeiros resistentes a ferrugem
(Universidade Federal de Viçosa, 2015-07-28) Almeida, Dênia Pires de; Caixeta, Eveline Teixeira
A ferrugem alaranjada causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix Berk. et Br. é considerada em todo o mundo uma séria doença do cafeeiro que tem causado vários prejuízos para a cafeicultura. O uso de fungicidas é o método mais empregado para o controle da doença, porém sua aplicação deve ser feita de forma racional, para não inviabilizar a cultura e agredir o meio ambiente. Na busca por cultivares resistentes, já foram identificados nove genes dominantes de resistência a H.vastatrix presentes em cafeeiros de diferentes espécies. Uma potencial estratégia para introgredir esses genes de resistência no cafeeiro é o uso de marcadores moleculares. Logo, objetivou-se com esse trabalho, converter marcadores AFLPs ligados a locos de resistência do cafeeiro à raça I, II e ao patótipo 001 de H. vastatrix em marcador SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) e avaliar a eficiência do uso desses marcadores e de um microssatélite previamente identificado na Seleção Assistida por Marcadores (SAM). Para isso, quatro combinações de primers AFLPs ligados à resistência do cafeeiro à raça I, II e ao patótipo 001 de H. vastatrix foram clonados e sequenciados. Os marcadores SCAR desenvolvidos foram denominados de SCAFs e, posteriormente, validados nos genitores resistente Híbrido de Timor UFV 443-03; genitor suscetível Catuaí Amarelo IAC 64 (UFV 2148-57) e em 247 indivíduos da população F 2 de mapeamento. Os dados foram codificados e analisados no programa GQMOL. Com as sequências dos SCARs foi feita uma busca local no banco de dados do genoma de referência de Coffea canephora utilizando a ferramenta BLAST, e-value de -27. A fim de identificar quais genes estão envolvidos nas regiões dos cromossomos onde os SCARs apresentaram maior similaridade, foi realizada uma busca local utilizando a ferramenta Gbrowse, e-value de -10. Para a realização da SAM foram genotipados o marcador SCAF2 validado e um marcador microssatélite SSR16 em indivíduos das populações F 3 e de retrocruzamentos suscetíveis . Na realização da fenotipagem dos 16 discos de folhas de 1,5 cm de diâmetro de cada planta dos genitores, da geração F 3 e dos retrocruzamentos foram inoculados com uredósporos da raça II. Após as inoculações, os discos foram colocados sobre uma tela de nylon e espuma, saturada com água e acondicionados no interior de um gerbox. Os gerbox contendo os discos de folhas, foram fechados e mantidos na ausência de luz durante 48 horas, a 22oC e, em seguida, transferidos para uma câmara sob condições controladas de temperatura de 22°C e 12 horas de luz. No momento em que os discos inoculados do genitor suscetível Catuaí Amarelo IAC 64 (UFV 2148-57) iniciou a esporulação, em torno dos 25 dias após a inoculação (dpi), foi iniciada a avaliação de resistência/suscetibilidade. Na validação dos marcadores SCARs apenas o marcador SCAF2 apresentou polimorfismo entre os cafeeiros resistentes e suscetíveis, se comportando como marcador dominante em repulsão. Os outros marcadores SCARs desenvolvidos não apresentaram polimorfismo entre os cafeeiros quando os fragmentos foram analisados em gel de agarose. Logo, somente o marcador SCAF2 foi validado mantendo o mesmo ordenamento no grupo de ligação 2 (GL2) do mapa genético de ligação, ficando ligado a 0 cM do AFLP que lhe deu origem. Na busca local no genoma de C. canephora encontrou-se maior similaridade dos marcadores SCAF1, SCAF2 com o cromossomo 0, chamado de ChrUn, e maior similaridade dos marcadores SCAF3 e SCAF4 com o cromossomo 10. Na identificação dos genes, os marcadores SCAF1 e SCAF2 pertencentes ao GL2 do mapa genético apresentaram similaridade com alguns genes que codificam proteínas relacionadas à resistência a patógenos. Na SAM, foi verificado que o uso dos marcadores moleculares permitiu selecionar indivíduos homozigotos dominantes para um dos locos e para os dois locos, sendo mais eficiente que a fenotipagem. Logo, com o desenvolvimento de marcadores SCAR e SSR16 intimamente ligados aos locos de resistência à ferrugem do cafeeiro e seu uso na SAM possibilitaram um avanço nos programas de melhoramento com a seleção precoce de indivíduos e também uma posterior clonagem posicional de genes ligados à resistência a essa doença.