UFV - Dissertações
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Item Diversidade, estrutura populacional e caracterização fisiológica de raças de Hemileia vastatrix(Universidade Federal de Viçosa, 2013-02-13) Cabral, Patrícia Gonçalves Castro; Zambolim, LaércioO fungo Hemileia vastatrix possui várias raças fisiológicas que refletem consideravelmente na sua diversidade genética. Nesse estudo, trinta e oito isolados monopustulares de H. vastatrix foram caracterizados em dezenove raças fisiológicas, dentre elas, as raças XXIX e XXX, relatadas pela primeira vez no Brasil. Onze novas raças, com diferentes combinações de genes de virulência, denominadas de UFV-Hv-01, UFV-Hv-02, UFV-Hv-03, UFV-Hv-04, UFV-Hv-05, UFV-Hv-06, UFV-Hv-07, UFV-Hv-08, UFV-Hv-09, UFV-Hv-10 e UFV-Hv-11 foram identificadas. Essas raças não possuem correspondência com outras raças de H. vastatrix descritas na literatura. A diversidade e estrutura genética de H. vastatrix foram analisadas em 115 isolados monopustulares, utilizando sete combinações de oligonucleotídeos AFLP, com o objetivo de verificar a influência do hospedeiro e da origem geográfica na estrutura genética da população do patógeno. Os isolados analisados, provenientes de Coffea arabica, C. canephora, derivados de Híbrido de Timor e Icatú (HDTI), foram coletados nos cinco principais Estados produtores de café do Brasil. A população de H. vastatrix apresentou baixo nível de diversidade genotípica, sendo obtidos 68 padrões AFLP. A diversidade gênica (h) na população de H. vastatrix foi de 0,027 e a hipótese de acasalamento ao acaso foi rejeitada na população total. Os isolados não apresentaram correlação entre distância geográfica e similaridade genética (r = -0,024, P = 0,74), indicando a ocorrência de dispersão dos urediniosporos à longas distâncias. A diferenciação genética (GST) entre as populações de H. vastatrix definidas por hospedeiro foi de 0,15 e nas populações definidas por Estado foi de 0,12. A análise de agrupamento dos dados AFLP não revelou a formação de grupos entre os isolados da mesma origem geográfica e hospedeiro, nem entre isolados de uma mesma raça fisiológica, embora a similaridade genética tenha sido superior a 90%. A AMOVA revelou que 90% da distribuição genética do patógeno ocorre entre os isolados dentro da subpopulação. O baixo grau de diferenciação nas populações de H. vastatrix no Brasil é consistente com a sua introdução, relativamente recente, e com a suscetibilidade à ferrugem apresentada pelos cultivares resistentes e derivados de HDTI. A elevada variação dentro das subpopulações sugere uma alta taxa evolutiva do patógeno e pode explicar a suplantação da resistência nos derivados de HDTI.Item Identificação de genes de Hemileia vastatrix candidatos a efetores capazes de ativar ou suprimir respostas de defesa no cafeeiro(Universidade Federal de Viçosa, 2015-03-23) Ramirez, Gustavo Marin; Brommonschenkel, Sérgio HerminioDurante a interação com a planta hospedeira, os fungos causadores de ferrugem secretam um arsenal de proteínas efetoras que modificam a estrutura e a função da célula hospedeira, permitindo o estabelecimento da interação biotrófica. Algumas dessas proteínas efetoras, denominadas proteínas de avirulência (Avr), são reconhecidas por proteínas codificadas por genes de resistência, o que desencadeia uma resposta de defesa da planta contra a infecção pelo patógeno. Estudos prévios demonstraram que a proteína HvEC-016 secretada por H. vastatrix apresenta características de proteína de avirulência quando expressa transientemente em genótipos de cafeeiros portadores do gene de resistência S H 1. No entanto, análises funcionais mais detalhadas ainda são necessárias para confirmar o papel dessa proteína durante a interação do patógeno com o cafeeiro. Desse modo, os objetivos deste estudo foram: (i) confirmar a atividade efetora da proteína HvEC_016 como fator de avirulência e/ou virulência em genótipos de cafeeiro com a presença ou ausência do gene de resistência S H 1; (ii) avaliar a estabilidade dos plasmídeos nos clones bacterianos utilizados nos estudos da expressão trasiente nos tecidos foliares de cafeeiro; (iii) identificar novas proteínas secretadas pela raça II de H. vastatrix (isolado Hv-01) que apresentam atividade de avirulência em cafeeiros com diferentes combinações de genes S H , utilizando o vetor de expressão transiente pEDV6 e o Sistema de Secreção Tipo III de Pseudomonas syringae pv. garcae (estirpe 1723). Confirmaram-se as atividades funcionais de avirulência e virulência da proteína HvEC_016 por meio da avaliação do crescimento populacional do clone Psg 1723 pEDV::HvEC_016 em plantas de cafeeiro com e sem o gene S H 1, respectivamente. A análise por PCR de colônia das células bacterianas isoladas a partir dos tecidos foliares infiltrados mostrou que o vetor pEDV6 apresentou estabilidade nos clones bacterianos analisados. A expressão transiente de cinco genes candidatos a efetores (HvEC_006, HvEC_054, HvEC_057, HvEC_081 e HvEC_101) suprimiu o desenvolvimento de sintomas da doença em cafeeiros portadores do gene S H 1. A análise do crescimento das populações desses clones em genótipos com ou sem o gene S H 1 deverá ser futuramente efetuada para comprovar os resultados obtidos. A expressão transiente de proteínas efetoras putativas no citoplasma do cafeeiro mediante a aplicação do sistema EDV constitui uma metodologia importante para a identificação de genes de avirulência e/ou virulência de H. vastatrix.Item Desenvolvimento e utilização de marcadores moleculares para seleção de cafeeiros resistentes a ferrugem(Universidade Federal de Viçosa, 2015-07-28) Almeida, Dênia Pires de; Caixeta, Eveline TeixeiraA ferrugem alaranjada causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix Berk. et Br. é considerada em todo o mundo uma séria doença do cafeeiro que tem causado vários prejuízos para a cafeicultura. O uso de fungicidas é o método mais empregado para o controle da doença, porém sua aplicação deve ser feita de forma racional, para não inviabilizar a cultura e agredir o meio ambiente. Na busca por cultivares resistentes, já foram identificados nove genes dominantes de resistência a H.vastatrix presentes em cafeeiros de diferentes espécies. Uma potencial estratégia para introgredir esses genes de resistência no cafeeiro é o uso de marcadores moleculares. Logo, objetivou-se com esse trabalho, converter marcadores AFLPs ligados a locos de resistência do cafeeiro à raça I, II e ao patótipo 001 de H. vastatrix em marcador SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) e avaliar a eficiência do uso desses marcadores e de um microssatélite previamente identificado na Seleção Assistida por Marcadores (SAM). Para isso, quatro combinações de primers AFLPs ligados à resistência do cafeeiro à raça I, II e ao patótipo 001 de H. vastatrix foram clonados e sequenciados. Os marcadores SCAR desenvolvidos foram denominados de SCAFs e, posteriormente, validados nos genitores resistente Híbrido de Timor UFV 443-03; genitor suscetível Catuaí Amarelo IAC 64 (UFV 2148-57) e em 247 indivíduos da população F 2 de mapeamento. Os dados foram codificados e analisados no programa GQMOL. Com as sequências dos SCARs foi feita uma busca local no banco de dados do genoma de referência de Coffea canephora utilizando a ferramenta BLAST, e-value de -27. A fim de identificar quais genes estão envolvidos nas regiões dos cromossomos onde os SCARs apresentaram maior similaridade, foi realizada uma busca local utilizando a ferramenta Gbrowse, e-value de -10. Para a realização da SAM foram genotipados o marcador SCAF2 validado e um marcador microssatélite SSR16 em indivíduos das populações F 3 e de retrocruzamentos suscetíveis . Na realização da fenotipagem dos 16 discos de folhas de 1,5 cm de diâmetro de cada planta dos genitores, da geração F 3 e dos retrocruzamentos foram inoculados com uredósporos da raça II. Após as inoculações, os discos foram colocados sobre uma tela de nylon e espuma, saturada com água e acondicionados no interior de um gerbox. Os gerbox contendo os discos de folhas, foram fechados e mantidos na ausência de luz durante 48 horas, a 22oC e, em seguida, transferidos para uma câmara sob condições controladas de temperatura de 22°C e 12 horas de luz. No momento em que os discos inoculados do genitor suscetível Catuaí Amarelo IAC 64 (UFV 2148-57) iniciou a esporulação, em torno dos 25 dias após a inoculação (dpi), foi iniciada a avaliação de resistência/suscetibilidade. Na validação dos marcadores SCARs apenas o marcador SCAF2 apresentou polimorfismo entre os cafeeiros resistentes e suscetíveis, se comportando como marcador dominante em repulsão. Os outros marcadores SCARs desenvolvidos não apresentaram polimorfismo entre os cafeeiros quando os fragmentos foram analisados em gel de agarose. Logo, somente o marcador SCAF2 foi validado mantendo o mesmo ordenamento no grupo de ligação 2 (GL2) do mapa genético de ligação, ficando ligado a 0 cM do AFLP que lhe deu origem. Na busca local no genoma de C. canephora encontrou-se maior similaridade dos marcadores SCAF1, SCAF2 com o cromossomo 0, chamado de ChrUn, e maior similaridade dos marcadores SCAF3 e SCAF4 com o cromossomo 10. Na identificação dos genes, os marcadores SCAF1 e SCAF2 pertencentes ao GL2 do mapa genético apresentaram similaridade com alguns genes que codificam proteínas relacionadas à resistência a patógenos. Na SAM, foi verificado que o uso dos marcadores moleculares permitiu selecionar indivíduos homozigotos dominantes para um dos locos e para os dois locos, sendo mais eficiente que a fenotipagem. Logo, com o desenvolvimento de marcadores SCAR e SSR16 intimamente ligados aos locos de resistência à ferrugem do cafeeiro e seu uso na SAM possibilitaram um avanço nos programas de melhoramento com a seleção precoce de indivíduos e também uma posterior clonagem posicional de genes ligados à resistência a essa doença.