UFSM - Teses
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Item Inibidores protéicos e seu potencial uso no controle de insetos-praga de importância para a cultura do café e do feijão(Universidade Federal de Santa Maria, 2005) Pereira, Railene de Azevedo; Sá, Maria Fátima Grossi deOs inibidores de α-amilase e de proteinases vegetais tem sido amplamente estudados, devido ao papel destes fatores de resistência contra insetos-praga. Este trabalho tem como objetivo identificar inibidores de α-amilase e de proteinases, presentes em sementes de Phaseolus coccineus e sementes de algaroba (Prosopis juliflora), com potencial inseticida no controle da broca-do-café (Hypothenemus hampei) e de pragas de grãos armazenados de feijão Acanthoscelides obtectus e Callosobruchus maculatus. Um gene que codifica para o inibidor de α-amilase de 223 resíduos de aminoácidos, denominado α AI-Pc1 foi clonado de sementes de Phaseolus coccineus, acesso 35590. αAI- Pc1 tem 70 a 98% de identidade de aminoácidos com outros inibidores de α-amilases de feijão, já descritos. Uma construção contendo o gene α AI-Pc1, regulado pelo promoter da fitohemaglutinina PHA-L, foi introduzida em plantas de fumo, via Agrobacterium tumefasciens. A presença e expressão do gene α AI-Pc1 em plantas transformadas (parental T0 e geração T1) foi confirmada por reação de cadeia da polimerase (PCR), Western blot e ELISA. Extrato protéico das sementes de plantas transformadas reagiram positivamente com o anticorpo policlonal contra o anticorpo αAI-1, enquanto que nenhuma reação foi observada em plantas não transformadas. Ensaios imunológicos mostraram que αAI-Pc1 representa cerca de 0,05% da proteína solúvel total de sementes de plantas (T0). A proteína recombinante expressa em plantas de fumo foi biologicamente ativa onde 125 ng de inibidor αAI-Pc1 inibe 65% da atividade da α-amilase de H. hampei. Utilizando semente de P. coccineus, acesso 35619, um inibidor de proteinase serínica pertencente à classe Bowman-Birk foi purificado utilizando técnicas cromatográficas que incluem coluna de troca iônica DEAE-Cellulose, coluna de filtração molecular Superdex 75, coluna fase-reversa líquida de alta pressão Vydac C-18 e Source 5RPC. O inibidor, denominado de PcBBI1, é uma proteína rica em cisteína e estável ao calor em pH alcalino. Análises por MALDI-TOF/MS mostraram que o inibidor PcBBI1 esta presente em semente de P. coccineus na forma de um monômero de 8.689 Da ou de um dímero de 17.378 Da. O efeito inibitório de PcBBI1 foi analisado por ensaio in vitro para tripsina e quimotripsina pancreática bovina e para proteinases digestivas de larvas de H. hampei. O inibidor foi fortemente ativo contra as enzimas semelhantes à tripsina de H. hampei, inibindo 80% da atividade proteolítica. Adicionalmente, um inibidor de proteinase cisteínica foi isolado das sementes de algaroba (Prosopis juliflora). Este inibidor, denominado de Pj, foi purificado usando uma coluna de filtração molecular Sephacryl S-200 seguido por uma coluna de fase-reversa líquida de alta pressão Vydac 18 TP. O inibidor Pj mostrou uma massa molecular de 20.000 Da por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS e massa molecular de 19.276 Da por espectrometria de massa. A inibição da papaína pelo inibidor Pj foi do tipo não-competitivo, com um valor de K i de 0.59 x 10 -9 . A atividade gelatinásica da papaína também foi fortemente inibida pelo inibidor Pj. A seqüência de aminoácidos da extremidade N-terminal do inibidor Pj mostrou homologia com a seqüência de aminoácidos da extremidade N-terminal de inibidores de proteinase da família Kunitz. Pj foi fortemente efetivo contra proteinases digestivas do gorgulho do feijão Acanthoscelides obtectus e do gorgulho de caupi Callosobruchus maculatus e foi moderadamente ativo contra proteinases digestivas do gorgulho da vagem Mimosestes mimosae e do gorgulho do feijão comum Zabrotes subfasciatus.