UFLA - Dissertações
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Resultados da Pesquisa
Item Seleção de genes de referência e perfis de expressão gênica da família LAV durante a embriogênese somática em cafeeiro(Universidade Federal de Lavras, 2015-02-26) Freitas, Natália Chagas; Paiva, Luciano VilelaVisando contribuir para a compreensão do processo de indução da embriogênese somática, fundamental para o desenvolvimento de protocolos de regeneração mais eficientes, objetivou-se com esse trabalho identificar, caracterizar e analisar os padrões de expressão dos genes da família LAV durante a embriogênese somática indireta de Coffea arabica L. a partir da normalização de dados de RT- qPCR com genes de referência adequados. A correlação da expressão dos genes com o potencial embriogênico foi realizada comparativamente com o auxílio de análises histológicas e regeneração de embriões somáticos em duas linhagens independentes de suspensões celulares. Primeiramente, foi analisada a estabilidade de expressão de doze candidatos a genes de referência (24S, ACT, GAPDH, CYCL, EF1a, TUB, PP47, PP2A, RPL39, APRT, UBQ, 14-3-3) em diferentes tecidos e fases de desenvolvimento relacionados a embriogênese somática do cafeeiro. As análises foram realizadas através da ferramenta RefFinder que compila os algoritmos estatísticos geNorm, NormFinder, BestKeeper e Delta-Ct. Os resultados obtidos sugerem que não há um gene de referência universal adequado para todas as variáveis experimentais. A expressão mais estável em calo não embriogênico, calo embriogênico e suspensão celular em diferentes tempos de cultivo correspondeu aos genes UBQ, ACT e APRT, respectivamente. O gene RPL39 apresentou maior estabilidade na análise em conjunto de calos não embriogênicos e embriogênicos. Enquanto em plântula e embrião nos diferentes estádios, PP2A apresentou maior estabilidade de expressão. A análise em conjunto de todas as amostras indicou que 24S e PP2A são os genes de referência mais adequados para normalização de dados de RT-qPCR. Com o auxílio de ferramentas de bioinformática, foram identificados apenas três possíveis ortólogos de VAL2 (C15, SEA1 e SIC1) dentre os genes da família LAV. Os perfis de expressão verificados in vivo diferiram dos obtidos in silico, os dados mostraram expressão quantitativa relativa variável do C15 e SIC1 em todas as amostras analisadas e ausência de expressão de SEA1 em todos os tecidos. Não foi verificado relação dos níveis de expressão de C15 e SIC1 com o potencial embriogênico. As linhagens de suspensões celulares apresentaram o mesmo padrão histológico e aumento da taxa de regeneração em função do tempo de cultivo. O bom desenvolvimento das plântulas obtidas a partir do protocolo utilizado pode ser reflexo da alta expressão de VAL2 nos embriões cotiledonares. O conhecimento da expressão de VAL2 abre perspectiva para a melhoria do sistema de propagação via embriogênese somática, visando assegurar a conversão de embriões em plântulas normais.Item Identificação e caracterização parcial de genes SEPALLATA em café arábica(Universidade Federal de Lavras, 2009-07-01) Paula, Márcia Fabiana Barbosa de; Chalfun Júnior, AntonioO café é um dos mais importantes commodity internacionais, produzido em mais de sessenta países e classificado entre as cinco exportações agrícolas mais valorizadas de países em desenvolvimento. Uma das maiores dificuldades dessa cultura consiste na heterogeneidade do florescimento, consequentemente, desuniformidade na maturação dos frutos, o que dificulta a colheita e prejudica a qualidade dos grãos. Tendo em vista a importância econômica do café e a dificuldade apresentada, este trabalho surgiu a partir da necessidade de um melhor entendimento dos fatores genéticos que compõe essa rota, já que o processo de florescimento depende da expressão equilibrada de uma rede complexa de genes. Os genes SEPALLATA (SEP) fazem parte dessa rota e são responsáveis pela determinação dos quatro verticilos florais, indicando com a ajuda de outros genes a identidade do meristema floral. Desta forma, esse trabalho teve como objetivo estudar os genes SEP em Coffea arabica. Primeiramente foram realizadas análises in silico para identificar esses genes no genoma café, por meio do banco de dados CAFEST. Três prováveis genes SEP, foram identificados e submetidos a análises de motivos, domínios, agrupados em árvores filogenéticas e análise da expressão por Northern eletrônico. Essas sequências apresentaram os domínios característicos da família gênica, agrupando com genes SEP de outras espécies, e como esperado, a expressão foi observada em bibliotecas de flores e frutos em desenvolvimento. Os experimentos para caracterização parcial foram realizados no Laboratório de Biologia Molecular da Universidade Federal de Lavras, UFLA, onde, após serem desenhados primers específicos, essas amplicons foram submetidas à clonagem, sequenciamento e comparação com genes SEP obtidas na análise in silico. Por meio de comparação, somente duas sequências foram consideradas similares e caracterizadas como possíveis genes SEP1/2 e SEP3. Além disso, foi realizada a análise de expressão por PCR em tempo real, onde também foram observadas as expressões dos fragmentos em tecidos de flores e frutos. Com todas essas análises foi possível a identificação e caracterização parcial de pelo menos dois genes SEP em café, porém, se faz necessário, a partir dos resultados obtidos, de trabalhos de expressão in situ e estudos de mutantes para uma melhor caracterização desses genes.Item Análise dos genes homólogos de florescimento em café arábica(Universidade Federal de Lavras, 2011-02-23) Barreto, Horllys Gomes; Chalfun Júnior, AntonioApesar dos vários estudos que abordaram a fisiologia e os processos de desenvolvimento do café, muitos aspectos diretamente relacionados com a qualidade do café ainda requerem uma melhor compreensão, como o processo de regulação do florescimento. A maturação desuniforme dos frutos do cafeeiro, gerada pelo florescimento sequencial encontrado nessa espécie, afeta diretamente a sua produtividade e leva a aumentos nos custos de produção e também a uma bebida de menor qualidade. Assim, objetivando uma melhor compreensão do processo de florescimento do café (Coffea arabica), realizou-se neste trabalho a identificação e caracterização dos genes FLOWERING LOCUS C, FRIGIDA, REDUCED VERNALIZATION RESPONSE 2 e VERNALIZATION INSENSITIVE 3 em café. Análises in silico realizadas no banco de ESTs (Expressed Sequence Tags) CAFEST permitiram a identificação dos genes estudados, os quais tiveram suas sequências confirmadas. As análises de expressão realizadas pela técnica da PCR quantitativa em tempo-real (qPCR) mostraram que os quatro genes foram expressos em todos os tecidos analisados (raízes, folhas de plantas submetidas ao estresse hídrico, folhas, e flores) e sugeriram que todos estejam envolvidos na regulação do florescimento em café. Estudos futuros que envolvam mutantes para esses genes em plantas- modelo e em café possibilitarão um melhor entendimento das funções desempenhadas por cada um desses genes no florescimento, assim como uma melhor compreensão desse processo como um todo.Item Caracterização in silico e análise da expressão de genes das rotas de biossíntese e sinalização do etileno em frutos de diferentes cultivares de café (coffea arabica)(Universidade Federal de Lavras, 2011-07-28) Lima, André Almeida; Chalfun Júnior, AntonioO café é a segunda mercadoria mais comercializada no mundo se colocando como uma importante fonte de renda e de empregos em vários países, principalmente nos países em desenvolvimento, como o Brasil, o maior produtor e segundo maior consumidor mundial de café. A qualidade do café, dentre outros fatores, está diretamente associada ao estádio de maturação dos frutos na época da colheita, o qual frequentemente apresenta uma grande desuniformidade devido ao florescimento sequencial do cafeeiro. Alguns trabalhos sugerem que o café constitua um fruto climatérico indicando que o etileno apresenta um importante papel na sua maturação. As cultivares precoces de café geralmente apresentam uma maior uniformidade na maturação de seus frutos, no entanto, pouco se sabe sobre os fatores genéticos que regulam esta característica de precocidade da maturação. Assim, este trabalho teve como objetivos realizar a caracterização in silico de prováveis genes das rotas de biossíntese e sinalização do etileno e analisar a expressão de alguns destes genes durante a maturação de frutos de uma cultivar tardia (Acauã) e precoce (Catucaí 785-15). As sequências selecionadas a partir das buscas realizadas no banco de dados CAFEST tiveram sua similaridade analisada por árvores filogenéticas sendo que seus perfis de expressão in silico foram analisados por Northerns eletrônicos. Os frutos do cafeeiro foram coletados no período de março a junho de 2008 e 2009 em intervalos de 30 dias e as análises de expressão gênica foram feitas por qRT- PCR. O banco de dados CAFEST apresentou um grande número de sequências relacionadas aos genes envolvidos na biossíntese e sinalização do etileno, permitindo a identificação de prováveis membros destas rotas em quase todos seus pontos. As árvores filogenéticas demonstraram a alta similaridade entre as sequências encontradas no CAFEST e aquelas de outras espécies, e os Northerns eletrônicos detectaram suas expressões em diferentes tecidos, estádios de desenvolvimento e condições de estresse. As análises de expressão para os prováveis genes que codificam para ACO (CaACO3) e para o receptor de etileno (CaETR4) mostraram que esses genes são diferencialmente regulados durante a maturação, com elevações de seus níveis nas coletas com maior porcentagem de frutos nas colorações vermelho-claro e cereja em ambas cultivares. O provável fator de transcrição ERF (CaERF4) parece apresentar elevados níveis de expressão durante todas as coletas não sendo diferencialmente expresso durante a maturação nas cultivares em estudo.