UFLA - Dissertações
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Item Identificação e expressão do gene Flowering Locus C (FLC) em café arábica(Universidade Federal de Lavras, 2009-02-13) Lazzari, Fabiane; Chalfun Junior, AntonioEste estudo teve como objetivo estudar um dos fenômenos envolvidos no florescimento em cafeeiros, através da análise do gene Flowering Locus C (FLC), principal repressor da transição floral em Arabidopsis. Os experimentos foram conduzidos no Laboratório Central de Biologia Molecular da Universidade Federal de Lavras, MG e na EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia/Cenargen em Brasília. A primeira etapa envolveu uma análise in silício para obtenção da seqüência FLC de C. arábica através do banco CAFEST de EST (Expressed Sequence Tags). As prováveis sequências FLC obtidas foram anotadas e submetidas à análise filogenética, e validadas quantos aos domínios conservados e bibliotecas de expressão. O único EST-contig de café pertencente à família FLC foi o C15. Primers específicos foram desenhados para clonar o gene e para análise de expressão tecido específica de qRT-PCR. O RNA total foi obtido a partir de tecidos de folha, raiz, fruto e flor de plantas de café. A partir do RNA total, o cDNA foi sintetizado através da transcriptase reversa e a sequência obtida após o sequenciamento foi comparada com aquela obtida in silício, apresentando similaridade, o que demonstra que a análise preliminar utilizando-se da bioinformática é uma ferramenta muito poderosa em estudos moleculares. Avaliando-se os níveis de expressão nos diferentes tecidos, foi possível observar que a expressão quantitativa relativa do gene FLC se dá diferencialmente entre os tecidos, sendo que em folhas foram observados os mais elevados níveis de expressão.Item Caracterização funcional de genes da família multdrug and toxic compound extrusion (MATE) envolvidos na adaptação de Coffea arabica à solos ácidos(Universidade Federal de Lavras, 2016-09-06) Pinto, Renan Terassi; Paiva, Luciano VilelaA partir da expansão da fronteira agrícola, o cultivo de espécies do gênero Coffea expandiu-se para áreas marginalizadas em termos de fertilidade de solos, como o Cerrado brasileiro. Os primeiros trabalhos relacionados ao levantamento das características deste ambiente evidenciaram, dentre outros aspectos, os problemas relacionados à toxidez do alumínio e a baixa disponibilidade de fosfatos. Apesar das técnicas aplicadas para a correção destes problemas serem amplamente difundidas, estas não são facilmente aplicadas em cultivos perenes e, além disso, baseiam-se na alteração do ambiente para o cultivo do vegetal, o que pode culminar em impacto ambiental. Dessa forma, o estudo dos mecanismos moleculares relacionados à adaptação pode impulsionar o desenvolvimento de programas de melhoramento genético, convencional e baseado em biotecnologia, que culminem na manutenção da produtividade do setor cafeeiro de forma sustentável. Neste contexto, a partir deste trabalho, objetivou-se elucidar os membros da família gênica Multi drug and toxic compound extrusion (MATE) em Coffea canephora afim de identificar, dentre os diversos membros desta família multifuncional, genes relacionados à tolerância ao alumínio e analisar a influência destes genes sobre os mecanismos de tolerância à este estresse em Coffea arabica. O estudo in silico da família MATE possibilitou a identificação de 60 proteínas presentes em C. canephora. Destacaram-se as proteínas CcMATE7 e CcMATE43 provavelmente relacionadas ao transporte de alcalóides em C. canephora, também alguns potenciais transportadores de flavonóides, CcMATE18 e CcMATE20 e a proteína CcMATE42, potencialmente associada ao efluxo do ânion citrato, que pode minimizar os efeitos tóxicos do alumínio solúvel e auxiliar a absorção de fosfatos. A partir deste candidato em potencial, foram identificados dois genes homeólogos em C. arabica, um relacionado ao subgenoma derivado do ancestral C. canephora (CaMATE_C) e outro do ancestral C. eugenióides (CaMATE_E). A partir de um experimento em hidroponia, foi demonstrado por RT-qPCR que estes homeólogos apresentam perfis distintos de expressão gênica sob estresse causado por exposição ao alumínio. O gene CaMATE_E foi considerado mais responsivo à este estímulo e com perfil de expressão condizente com a exsudação de citrato, mesmo não havendo elementos cis-regulatórios especificamente relacionados à tolerância à alumínio que expliquem esta diferença. Em conclusão, este trabalho pode fornecer informações relevantes para os estudos relacionados aos mecanismos de adaptação de espécies do gênero Coffea à solos ácidos, sendo estes pertinentes para o cultivo produtivo e sustentável do cafeeiro neste ambiente.Item Avaliação molecular de sementes de café submetidos à criopreservação(Universidade Federal de Lavras, 2016-11-21) Veloso, Juliana Souza; Rosa, Sttela Dellyzette Veiga Franco daAs sementes de café apresentam baixa longevidade e sensibilidade à dessecação, o que limita seu armazenamento em bancos de germoplasma convencionais. Como método alternativo para a conservação tem sido estudado o armazenamento em temperatura ultra-baixa utilizando nitrogênio líquido. Entretanto, ainda não são completamente conhecidas as alterações moleculares que ocorrem em sementes de café armazenadas nestas condições. Assim, objetivou-se com este trabalho avaliar a expressão de genes em sementes de café submetidas a diferentes protocolos de criopreservação visando ampliar o conhecimento em nível molecular dos efeitos da criopreservação sobre a viabilidade destas sementes e auxiliar na compreensão e interpretação de resultados fisiológicos, bioquímicos e moleculares. A expressão dos genes alvo varia conforme a metodologia de secagem, de pré-resfriamento e o tempo de reaquecimento. O uso de cloreto de sódio (75 % UR) para a secagem e/ou a ausência de pré- resfriamento resulta em maior expressão dos genes isocitrato liase, esterase, dehidrina e apetala 2 nas sementes de Coffea arabica L. cv. Catuaí amarelo IAC 62 do que às demais metodologias de secagem e pré-resfriamento. O uso do sulfato de amônio (85 % UR) para a secagem e/ou o pré-resfriamento até -50 °C proporciona maior expressão dos genes telomerase, inibidor de apoptose e DNA metilase nas sementes de Coffea arabica L. cv. Catuaí amarelo IAC 62 do que às demais metodologias de secagem e pré-resfriamento ou em ausência de pré-resfriamento. Os genes telomerase, inibidor de apoptose e DNA metilase, bem como os genes ascorbato peroxidase, superóxido dismutase e peroxidase apresentam padrão de expressão similar.Item Análise da expressão dos genes da subfamília DREB em resposta à seca em plantas de Coffea canephora Conilon(Universidade Federal de Lavras, 2016-03-30) Reichel, Tharyn; Marraccini, Pierre Roger RenéCoffea canephora é uma das espécies de cafeeiro mais importantes economicamente e no Brasil, Conilon é a planta mais amplamente cultivada dessa espécie. Estresses abióticos como as variações de temperatura e períodos de seca são fatores que afetam significativamente a sua produção e tendem a se agravar com as mudanças climáticas reconhecidas mundialmente. Na tentativa de compreender as respostas moleculares do cafeeiro em condições de déficit hídrico, recentes estudos identificaram genes candidatos (GCs), como CcDREB1D. Este gene apresentou maior expressão em resposta à seca nas folhas do clone 14 (tolerante à seca) em relação ao clone 22 (sensível à seca) de C. canephora Conilon. Baseado nesses resultados, na identificação dos genes DREB e seus subgrupos (SGs) de C. canephora, objetiva-se analisar a expressão in silico e também in vivo desses genes de C. canephora nas folhas e raízes de clones tolerantes (14, 73 e 120) e sensível (22) de C. canephora Conilon submetidas ou não a um déficit hídrico. As expressões in sílico de todos os genes DREB foram analisadas a partir do Banco de Dados Coffee Genome Hub e a expressão in vivo foi realizada pela técnica "reverse transcription- quantitative PCR" (RT-qPCR). Nas análises de expressão gênica in sílico foi possível identificar genes DREB com potenciais respostas aos estresses abióticos, corroborando com alguns resultados validados in vivo. Nesta análise, diversos genes mostraram expressão diferencial em resposta à seca entre os SGs (I-IV), os clones tolerantes e sensível e as folhas e raízes. Esses genes com expressão diferencial foram identificados como potenciais GCs e entre eles, verificou-se que a maioria dos clones tolerantes apresentou maior expressão em relação ao sensível em resposta à seca, com os maiores níveis de expressão para os clones 14 e 73. Esses maiores níveis foram observados em folhas quando comparado com as raízes e o SG-I se destacou pelo maior número de genes expressos em resposta à seca. Esses resultados sugerem que os GCs DREB, como Cc05_g06840, Cc02_g03420 e Cc08_g13960, desempenham um papel importante nos mecanismos regulatórios de resposta à seca em C. canephora Conilon.Item Isolamento e caracterização do gene CaLTP em Coffea spp(Universidade Federal de Lavras, 2012-07-16) Cotta, Michelle Guitton; Marraccini, PierreAs proteínas de transferência de lipídeos não-específicas (nsLTPs) são proteínas básicas caracterizadas por resíduos de cisteínas conservados, baixa massa molecular e alto conteúdo de α-hélices. Tais proteínas foram originalmente definidas pela capacidade de transferir fosfolipídeos in vitro. As nsLTPs estão envolvidas nos mecanismos de proteção das plantas contra estresses bióticos causados por fungos, vírus e bactérias. Evidências evolutivas sugerem que essas proteínas surgiram muito cedo durante a evolução das plantas terrestres. Uma família multigênica confere a expressão dos genes nsLTPs, o que pode explicar o padrão de expressão diferencial de acordo com o tecido, estádio de desenvolvimento e condições fisiológicas. Esses genes são responsivos a estresses abióticos tais como déficit hídrico, baixas temperaturas, salinidade e exposições a metais pesados. Considerando a importância das nsLTPs no metabolismo das plantas, o presente estudo objetiva: (i) identificar os diferentes genes nsLTPs homoeólogos de café que correspondem aos subgenomas ancestrais de Coffea arabica (Ca): Coffea canephora (Cc) e Coffea eugenioides (Ce); (ii) avaliar a expressão desses alelos durante o desenvolvimento do fruto (iii) estudar os efeitos da seca na expressão das nsLTPs em C. arabica; (iv) clonar o promotor de um dos genes codificando nsLTP de C. arabica e testar sua regulação em plantas de tabaco transgênicas. Northern eletrônico foi realizado com os dados do Projeto Genoma EST Brasileiro e identificou-se o gene CaLTP (Coffea arabica Lipid Transfer Protein) altamente expresso em frutos de café. Os resultados dessa análise in silico foram confirmados por ensaios de RT-qPCR e de Northern blot, os quais destacaram a expressão preferencial deste gene em endosperma nos frutos de C. arabica aos 90 e 120 dias após a floração (DAF). A região promotora do gene CaLTP3 (1,2 kb) foi isolada. Deleções 5’ nessa sequência foram feitas para testar a capacidade de controlar a expressão do gene repórter uidA em plantas transgênicas de Nicotiana tabacum. Os ensaios histoquímicos da atividade GUS mostram que os fragmentos de 1,2 kb, 1,0 kb e 0,8 kb direcionaram a expressão de uidA para todos os órgãos testados da planta. Esses fragmentos promovem expressão baixa ou nula em raízes. O fragmento de 0,4 kb direcionou a expressão do gene uidA somente em sementes. As expressões dos homoeólogos CaLTP dos subgenomas de Cc e Ce de Ca foram identificadas usando combinações específicas de iniciadores. Os cDNAs e os genes codificando a proteína nsLTP, do tipo 2, foram clonados e sequênciados permitindo a identificação das formas ortólogas e homeólogas da CaLTP (CaLTP1a, CaLTP1b, CaLTP2, CaLTP3a, CaLTP3b e CcLTP3).Item Análise funcional do gene órfão CcUNK8 de Coffea canephora via transformação genética de Setaria viridis(Universidade Federal de Lavras, 2014-07-30) Duarte, Karoline Estefani; Marraccini, Pierre RogerO cafeeiro é um dos mais valiosos produtos primários no comércio mundial. Em razão dessa importância econômica, o cafeeiro vem sendo alvo de programas de melhoramento genético visando à introdução de novos caracteres para obtenção de plantas com características agronômicas superiores, por exemplo, com uma maior tolerância à seca. Porém, como melhoramento convencional do cafeeiro é demorado, o uso das últimas técnicas de genômica está sendo desenvolvido para acelerar a criação de novas plantas. Assim, o sequenciamento do genoma e, também, o sequenciamento em larga escala de genes expressos (RNAseq) torna-se algo necessário para analisar o determinismo genético da tolerância à seca e identificar genes candidatos (GCs) atuantes neste determinismo. No cafeeiro, mas também em outras plantas como Arabidopsis thaliana, Oryza sativa e microrganismos, pelas análises dos projetos de sequenciamento demostra-se uma alta porcentagem (cerca de 20- 30%) de genes considerados no hits, ou seja, genes para os quais nenhuma similaridade com as sequências depositadas nos bancos de dados é encontrada. Em Coffea canephora e Coffea arabica foram identificados e caracterizados alguns genes no hits. Alguns desses genes possuem um perfil de expressão onde se observa in silico uma distribuição heterogênia quanto a tecidos e tratamentos utilizados, como é o caso do no hit 33656. Infere-se que no hits possam ter se originado de processos de especiação, portanto poderiam estar interligados a vias de resposta únicas de organismos tolerantes ou susceptíveis a uma dada condição. Pelos dados de qPCR mostra-se que o no hit CcUNK8 apresentou maior expressão em folhas estressadas quando comparado a folhas controle de C. canephora sendo um gene canditado à tolerância à seca e foi, então, selecionado para transformação genética utilizando Setaria viridis como planta modelo.O T-DNA contendo o gene CcUNK8 foi inserido em plantas de Setaria viridis via Agrobacterium tumefaciens e a expressão deste gene foi quantificada por meio de qPCR nos eventos primários de transformação. Em alguns eventos foi observado um acúmulo de biomassa maior de parte aérea e radicular que indivíduos não transformados. Foram observadas, ainda, diferenças no acúmulo de biomassa entre o mesmo evento quando submetido ao tratamento irrigado e não-irrigado.Item Identificação e caracterização de genes órfãos (“no hits”) de café (Coffea spp.)(Universidade Federal de Lavras, 2013-02-28) Vieira, Natalia Gomes; Andrade, Alan CarvalhoO café é uma das commodities agrícolas mais importantes mundialmente. Programas de melhoramento genético que visam a introdução de caracteres para obtenção de novas variedades com características agronômicas superiores, como floração uniforme, rendimento, tamanho do grão, qualidade da bebida, menor teor de cafeína e resistência à doenças e à seca estão em andamento à décadas. Contudo, com um número considerável de sequências gênicas disponíveis nos bancos de dados Coffea spp., a identificação e a caracterização de novos genes com função desconhecida (no hits) é viável e indispensável. O objetivo com este trabalho consistiu em identificar e caracterizar funcionalmente, por meio de análises in silico e por qPCR da expressão gênica, no hits encontrados nas bases de dados do café. Para as análises in silico os no hits foram identificados por meio da busca por similaridade nos bancos de dados do NCBI. Bibliotecas de Coffea arabica e Coffea canephora de diferentes tecidos foram geradas a partir dos dados de sequenciamento utilizando o método Sanger e o método 454. Foi realizado um Northern eletrônico dos no hits nas diferentes bibliotecas de café. Para os ensaios de qPCR o material vegetal utilizado foi proveniente de diferentes tecidos (folhas, raízes, frutos e meristemas) das espécies de C. arabica e C. canephora, submetidos à diferentes condições biológicas (estresse biótico e abiótico) e frutos em estádios de desenvolvimento inicial, intermediário e tardio. Mil quinhentos e sessenta e oito genes órfãos foram identificados e caracterizados nas análises in silico, de acordo com as bibliotecas em que foram expressos. Com isso, foram selecionados e testados em qPCR, dezessete genes órfãos potencialmente envolvidos na tolerância a estresses bióticos e abióticos, assim como genes órfãos implicados no desenvolvimento do fruto de café. Estes genes responderam diferencialmente nos tecidos e condições biológicas analisadas, corroborando com as análises in silico previamente apresentadas e oferecendo indícios de uma provável participação em processos biológicos específicos do cafeeiro.Item Avaliação do potencial embriogênico de suspensões celulares de Coffea arabica(Universidade Federal de Lavras, 2013) Torres, Luana Ferreira; Paiva, Luciano VilelaA suspensão de células embriogênicas (ECS) é iniciada pela inoculação de calos friáveis em meio líquido e sob agitação constante, se mostrando como um sistema de propagação in vitro bastante eficiente para aplicações biotecnológicas. As análises da morfologia das células e a caracterização ultraestrutural, por meio das microscopias fotônica e eletrônica, permitem visualizar a transição das células somáticas para embriogênicas, através das características diferenciadoras entre as células, inferindo se o material possui potencial embriogênico. Além disso, o uso de genes marcadores moleculares estádio-específicos apresenta-se como estratégia para o estudo dos processos da embriogênese somática, permitindo uma melhor compreensão dos aspectos moleculares desses processos de desenvolvimento, além de propiciar a possibilidade de otimização de sistemas e protocolos de embriogênese somática. No capítulo 2, objetivou-se relacionar a estrutura morfológica e ultraestrutural de ECS de Coffea arabica cv. Bourbon com seu potencial embriogênico, através da curva de crescimento e das microscopias fotônica, de varredura e de transmissão. No período analisado, a curva de crescimento da ECS apresentou três fases distintas: lag (0 a 4 dias), exponencial (4 a 20 dias) e desaceleração (20 a 28 dias). Os procedimentos de subcultivos para manutenção e multiplicação das ECS devem ocorrer ao final da fase exponencial ou início da fase de desaceleração, bem como a renovação do meio de cultivo. Dois tipos celulares foram identificados: Tipo 1, apresentou características altamente embriogênicas, tais como: células pequenas com citoplasma denso, ausência de grandes vacúolos, núcleo grande e nucléolos proeminentes e presença de grãos de amido; Tipo 2, apresentou células grandes, dispersas, vacuoladas, com ausência de núcleos, pouca ou nenhuma presença de grãos de amido. A análise por MEV das amostras com quatro dias mostrou a presença de células arredondadas e isodiamétricas, formando os aglomerados celulares e menor frequência de células murchas, além da presença de células em divisão. Nas amostras com 28 dias notou-se a presença de células assimétricas, murchas e rompidas. As análises por MET permitiram visualizar na amostra de 4 dias, células com núcleo e nucléolo proeminente, alta razão núcleo/citoplasma, abundante presença de amiloplastídeos e parede celular com pequenos espaços intercelulares. Nas amostras de 28 dias, a grande presença de vacúolos, alguns ocupando quase que totalmente o citoplasma, grandes espaços intercelulares e ausência de conteúdo celular. No capítulo 3, objetivou-se relacionar a renovação do meio nutritivo com a morfologia das células e a expressão dos genes SERK e BBM de ECS de Coffea arabica cv. Catiguá. Todas as ECS coletadas (30, 45, 60 e 75 dias) possuíam significativos aspectos embriogênicos, exceto aos 75 dias, que também apresentou materiais com características não embriogênicas. Com relação à expressão dos genes marcadores, as análises de expressão sugerem uma relação transiente de indução entre SERK e BBM durante o crescimento da suspensão celular. A renovação quinzenal de 90% do meio de cultura ocasiona um nível de estresse às células, com relação direta na expressão dos genes, ou seja, não permite aos genes sua expressão natural.Item Análise dos genes homólogos de florescimento em café arábica(Universidade Federal de Lavras, 2011-02-23) Barreto, Horllys Gomes; Chalfun Júnior, AntonioApesar dos vários estudos que abordaram a fisiologia e os processos de desenvolvimento do café, muitos aspectos diretamente relacionados com a qualidade do café ainda requerem uma melhor compreensão, como o processo de regulação do florescimento. A maturação desuniforme dos frutos do cafeeiro, gerada pelo florescimento sequencial encontrado nessa espécie, afeta diretamente a sua produtividade e leva a aumentos nos custos de produção e também a uma bebida de menor qualidade. Assim, objetivando uma melhor compreensão do processo de florescimento do café (Coffea arabica), realizou-se neste trabalho a identificação e caracterização dos genes FLOWERING LOCUS C, FRIGIDA, REDUCED VERNALIZATION RESPONSE 2 e VERNALIZATION INSENSITIVE 3 em café. Análises in silico realizadas no banco de ESTs (Expressed Sequence Tags) CAFEST permitiram a identificação dos genes estudados, os quais tiveram suas sequências confirmadas. As análises de expressão realizadas pela técnica da PCR quantitativa em tempo-real (qPCR) mostraram que os quatro genes foram expressos em todos os tecidos analisados (raízes, folhas de plantas submetidas ao estresse hídrico, folhas, e flores) e sugeriram que todos estejam envolvidos na regulação do florescimento em café. Estudos futuros que envolvam mutantes para esses genes em plantas- modelo e em café possibilitarão um melhor entendimento das funções desempenhadas por cada um desses genes no florescimento, assim como uma melhor compreensão desse processo como um todo.