SPCB - Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil
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Resultados da Pesquisa
Item Construção de macroarranjos de cDNA de café, para a identificação de genes de interesse agronômico(2007) Vinecky, Felipe; Vieira, Natália G.; Ferreira, Daniela L.A.; Freire, Luciana P.; Marraccini, Pierre Roger Rene; Silva, Felipe R. da; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - CaféPara a construção dos macroarranjos, foi gerado inicialmente um conjunto não redundante de clones (Unigene), resultante da análise do banco de dados gerado no projeto Genoma Café. Utilizando-se um sistema automatizado para o rearranjo (Q-Bot), um conjunto não redundante com aproximadamente 33 mil clones foi rearranjado, perfazendo um total de 86 placas de 384 poços. O DNA plasmidial de todo esse conjunto de clones (33 mil), foi extraído e amostras representativas de cada uma das placas foi analisada por eletroforese em gel de agarose. Com o objetivo de se ter uma idéia do resultado do rearranjo, 4 clones aleatórios (1 clone/ quadrante de 96) de cada placa de 384 foram seqüenciados e comparados por análises de BlastN na Base de Dados do Genoma Café, para a confirmação da identidade dos clones. Do total de seqüências analisado, verificou-se uma porcentagem de 8% de erros ocorridos no rearranjo. Essas placas foram rearranjadas e amostras, novamente seqüenciadas. Após essa etapa, as membranas serão construídas e o presente trabalho teve como objetivo, avaliar a metodologia para a construção de macroarranjos, em escala piloto, para se determinar as melhores condições para a impressão de DNA nas membranas do Unigene Café. Foram avaliados os parâmetros, tipo de DNA a ser impresso (DNA plasmidial vs. Produto de PCR) e a concentração a ser utilizada. De modo geral, a impressão das membranas utilizando-se o equipamento Q-Bot (Genetix) foi bastante uniforme entre as repetições, apresentando muito baixa variação e como esperado, os sinais radioativos apresentados pelos produtos de PCR, foram superiores aos de plasmídeo, devido à razão molar diferente e provável melhor desnaturação devido ao fato de serem fragmentos de DNA lineares.Item Análises integradas de proteômica e metabolômica associadas à qualidade do café(2007) Silva, Vladimir Costa; Melo, Jorge A. T.; Barbosa, Éder A.; Silva, Luciano P. da; Bloch, Carlos; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - CaféA recente introdução de tecnologias proteômicas e metabolômicas na análise e pesquisa da qualidade de alimentos inaugura uma nova era de caracterização e identificação molecular. A pesquisa com café, em particular, experimenta um incrível desenvolvimento nas áreas de caracterização de sabor, aroma e qualidade de frutos. O presente estudo demonstra os benefícios da integração de estratégias proteômicas e metabolômicas para avaliar dois tipos de grãos de café pré-selecionados por critérios de seleção sensoriais. Os resultados até agora claramente indicam a existência de proteínas diferenciais e pequenas moléculas que podem ser utilizadas na identificação de marcadores moleculares associados à qualidade.Item Análise da expressão de genes candidatos para a tolerância à seca em folhas de clones de Coffea canephora var. Conillon, caracterizados fisiologiamente(2007) Marraccini, Pierre Roger Rene; Silva, Vânia Aparecida; Elbelt, Sonia; Guimarães, Breno Lourenzzo Salgado; Loureiro, Marcelo Ehlers; DaMatta, Fábio Murilo; Ferrão, Maria Amélia Gava; Fonseca, Aymbiré Francisco Almeida da; Silva, Felipe R. da; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - CaféGenes candidatos envolvidos na tolerância à seca no cafeeiro, foram selecionados através de uma analise in silico (Northern eletrônico) das bibliotecas de cDNA SH2 e SH3 presentes na Base de Dados do Genoma Café. Assim, 18 "contigs" apresentando, uma expressão diferencial nas análises in silico, foram identificados e caracterizados por análises de Northern-blot, utilizando-se RNA total extraído de folhas de clones de Coffea canephora var. Conillon, sensíveis e tolerantes à seca, caracterizados fisiologicamente em experimentos com vasos realizados em casa de vegetação. Os resultados de caracterização fisiológica indicam que o clone 22 (sensível) apresentou queda mais rápida do potencial hídrico, devido à maior condutância estomática. Além disso, sob -3,0MPa, o clone 22 apresenta menor fotossíntese que os demais, devido ao maior estresse oxidativo que ocorre nas folhas. Os resultados das análises da expressão gênica indicam que a maioria dos genes candidatos identificados pelas análises de Northern eletrônico, também apresentavam expressão diferencial nas análises por Northern-blot. Além disso, alguns desses genes candidatos, apresentavam perfil de expressão diferencial entre os quatro materiais genéticos testados (clones sensíveis vs. tolerantes à seca). Perspectivas de uso dessas informações são discutidas. Palavras-chave: tolerância seca, estresseItem Construção de uma biblioteca genômica de cromossomo artificial de bactéria de Coffea arabica(2007) Cação, Sandra Maria Bellodi; Diniz, Leandro Eugenio Cardamone; Silva, Nathalia V.; Veniky, Filipe; Andrade, Alan Carvalho; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Embrapa - CaféA produção de mapas físicos em plantas tem grande importância para estudos de genética e melhoramento. O passo inicial para produção destes mapas é a construção de bibliotecas genômicas com largos fragmentos de DNA, em vetores do tipo cromossomo artificial de bactéria (BAC) ou de levedura (YAC). Visando a produção de um mapa físico, o objetivo deste trabalho foi construir uma biblioteca genômica de BAC de café. Fragmentos de DNA de alto peso molecular de C. arabica híbrido de Timor cv. 832/2 foram clonados no vetor pCC1BAC e transformados em E. coli DH10B. Após transformação 57000 clones foram inicialmente obtidos e ordenados manualmente em placas de 96 poços. A biblioteca foi transferida em triplicata para placas de 384 poços, com equipamento Q-BOT, resultando em 55.778 clones em 148 placas. A verificação do tamanho do inserto de 130 clones revelou tamanho médio de 115-120 Kb. A cobertura do genoma haplóide estimada para C.arabica foi de cinco vezes. A validação da biblioteca presença de DNA de cloroplasto e mitocôndria, assim como a seleção inicial com sondas para iniciar o mapeamento físico, está sendo realizada através de hibridização de colônias em membranas contendo 18.462 clones em duplicata.Item Imagens por espectrometria de massa (IMS) como uma ferramenta inovadora para estudos moleculares de frutos de café(2007) Silva, Luciano P. da; Vinecky, Felipe; Barbosa, Éder A.; Andrade, Alan Carvalho; Bloch, Carlos; Embrapa - CaféO desenvolvimento do fruto de café é um processo que pode durar de algumas poucas semanas a mais do que um ano dependendo da espécie e se inicia com a antese até a completa maturação dos frutos. A espécie Coffea arabica requer de 6-8 meses para atingir a maturação. Devido a diversas florações poderem ocorrer em C. arabica em uma mesma estação produtiva, o crescimento dos frutos é assíncrono, com uma mesma planta podendo apresentar proporções variadas de frutos em diferentes estágios de desenvolvimento, o que pode prejudicar a qualidade final da bebida. Com exceção do grande número de estudos relacionados com o metabolismo da cafeína, muito pouco se sabe acerca de proteínas e vias metabólicas importantes para a qualidade da bebida de café. Dessa forma, estudos de expressão de proteínas associados com o perfil de distribuição das proteínas nos tecidos podem fornecer informações importantes para o melhor entendimento do envolvimento de macromoléculas durante o desenvolvimento do fruto de café. A obtenção de imagens moleculares a partir de íons detectados por meio de métodos de espectrometria de massa tem aberto uma nova fronteira no que diz respeito à detecção de moléculas em amostras de tecido. Esta metodologia denominada imaging mass spectrometry tem sido utilizada com sucesso para o mapeamento espacial de peptídeos e proteínas diretamente de amostras de diversos tecidos. No presente estudo, a distribuição espacial de macromoléculas durante diferentes estágios de desenvolvimento de frutos de café é apresentada. Adicionalmente, com a utilização de técnicas de cromatografia foi possível identificar uma proteína diferencialmente expressa e com prováveis modificações pós-traducionais em certas regiões do endosperma.Item Análise in silico de genes potencialmente envolvidos na resposta aos estresses abióticos, presentes na base de dados do genoma café(2005) Vinecky, Felipe; Brito, Kelly Martins de; Silva, Felipe R. da; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - CaféOs danos potenciais dos estresses abióticos tais como seca, salinidade e temperaturas extremas na produção agrícola mundial é alarmante, tendo em vista as constantes alterações climáticas observadas nas últimas décadas ao redor do globo. Desta forma, a ampliação do conhecimento científico acerca dos fatores genéticos envolvidos na tolerância dos vegetais a esses estresses, com vistas ao melhoramento genético destas características, é prioritário. Foi concluído recentemente, com o apoio do Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café (CBP&D-Café), o projeto Genoma Café. Este projeto consistiu no seqüenciamento em larga escala de genes expressos (ESTs) de café e teve como meta, identificar e anotar de 20 a 30.000 genes de Coffea spp. a partir do seqüenciamento de 200.000 clones de ESTs obtidos de diversas bibliotecas de cDNA, inclusive aquelas oriundas de material vegetal submetido a estresses abióticos. Com a conclusão do projeto, está disponível para pesquisa um banco de dados contendo uma parcela significativa dos genes expressos em café (transcriptoma), associados às diversas condições de estresse submetidas ou tecidos utilizados para a construção das bibliotecas. O objetivo do presente trabalho, foi realizar uma análise prospectiva dos fatores genéticos potencialmente associados à resposta aos estresses abióticos, presentes na Base de Dados do Genoma Café. Essa análise baseou-se na identificação de genes de café com alta similaridade aos previamente descritos, caracterizados como genes envolvidos na resposta aos estresses abióticos (EREA), em outras espécies vegetais. Através das análises de tBlastn, genes de café com alto nível de similaridade (e-value [=ou<] 10-20) aos 355 genes EREA pesquisados, foram identificados, em mais de 91% dos casos. Apenas 5% dos genes EREA pesquisados, não resultaram em genes análogos de café, com nível significativo de similaridade (e-value [=ou<] 10-5). A observação de que a maioria desses genes não encontrados na base de dados do café, são genes relacionados às respostas ao frio, pode ser justificada pela ausência de ESTs provenientes de bibliotecas de cDNA, com esse tipo de estresse. Por outro lado, essas diferenças poderiam estar relacionadas às diferenças fisiológicas marcantes entre arabidopsis e cafeeiro, com relação à tolerância ao frio, uma vez que grande parte dos genes EREA utilizados nesta pesquisa, são provenientes de arabidopsis. Pode-se concluir com os resultados obtidos, que a utilização da Base de Dados do Genoma Café é uma ferramenta poderosa na rápida identificação e seleção de potenciais genes de interesse agronômico de café, para a realização de ensaios experimentais de caracterização funcional.Item Determinação dos teores de ácido abscísico, durante a fase de maturação de sementes de Coffea arabica e Coffea canephora(2005) Silva, Edvaldo A. A. da; Braga, Elvis A.; Brito, Kelly Martins de; Vinecky, Felipe; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - CaféO ácido abscísico (ABA) é um hormônio natural envolvido na regulação da expressão gênica em importantes processos fisiológicos vegetais. Durante o crescimento vegetativo das plantas, o ABA atua nas respostas a vários fatores de estresses ambientais tais como seca e condições de alta salinidade. O ácido abscísico também desempenha importante função fisiológica, durante o processo de formação de sementes, sendo necessário para desencadear a síntese de lipídeos e proteínas de reserva, na ocorrência de dormência e na aquisição de tolerância à desidratação e ao frio. Desta forma, a caracterização da expressão gênica sob a regulação do ácido abscísico, durante a maturação de sementes de espécies vegetais, pode proporcionar importantes ferramentas para aplicação na biotecnologia e engenharia genética. Entretanto, muito pouco é sabido sobre as bases genéticas e os determinantes moleculares destes aspectos, em sementes do cafeeiro. Assim, o objetivo desde trabalho foi o de determinar os teores de ABA durante a fase de maturação de sementes de Coffea arabica e Coffea canephora, assim como, identificar e caracterizar os genes regulados por esse hormônio. Amostras das sementes de Coffea arabica cv. Rubi e C. canephora cv. Apoatã IAC foram coletadas dos 120 até 270 d.a.f. (dias após a floração), em intervalos de 30 dias. Os embriões foram isolados, congelados em nitrogênio líquido e posteriormente liofilizados e macerados. Parte das amostras foi utilizada para a quantificação de ABA e a outra parte, para a extração de RNA. A análise da expressão foi realizada em membranas, contendo DNA de 96 genes, previamente selecionados na Base de Dados do Genoma Café. A seleção dos genes foi baseada em estudos anteriores, realizados com Arabidopsis, indicando o efeito do ABA na regulação de genes similares. Os resultados indicam um acúmulo máximo de ABA, por volta de 180 d.a.f. para C. arábica e 210 d.a.f. para C. canephora. Resultados preliminares da expressão gênica, indicam que a variação no teor de ABA, durante a fase de maturação de sementes de café, tem efeito direto na expressão de vários dos genes analizados.Item Determinação do unigene do Projeto Genoma Café(2005) Sales, Raphael M. O. B.; Andrade, Alan Carvalho; Silva, Felipe R. da; Embrapa - CaféO Projeto Genoma Café gerou seqüências parciais de mais de duzentos mil clones de EST (Expressed Sequence Tag). Essa estratégia gera dados redundantes. Nesse trabalho, selecionamos o conjunto mínimo de clones que representam todos os transcritos encontrado no projeto. Para tanto, as 213.157 seqüências geradas pelo projeto, apos um processo criterioso que resultou em 145.507 seqüências limpas, foram agrupadas por similaridade dando origem a 32.958 possíveis transcritos, aqui chamados de Unigenes. Para cada Unigene, determinamos o clone correspondente à extremidade 5' o que, pela metodologia empregada na construção das bibliotecas, deve corresponder ao clone de maior extensão. Todos os resultados obtidos foram centralizados e organizados em uma base de dados relacional, de forma a facilitar sua utilização em posteriores aplicações de diferentes plataformas e linguagens. O SGDB usado foi o PostgreSQL. Desenvolvemos uma interface Web usando as linguagens PHP e Perl rodando sobre o Apache para permitir a usuários acesso aos dados de maneira simplificada e rápida. Escolhemos essas ferramentas por serem todas de código livre, permitindo personalizações, se necessárias, e por não agregarem nenhum vinculo de licença.Item Expressão de genes em ramos de café depauperado com a presença de Xylella fastidiosa(2003) Mehta, Angela; Oliveira, Angélica C. de; Eira, Mírian T. S.; Leite, Rui Pereira; Andrade, Alan Carvalho; Silva, Felipe R. da; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféA cultura do café possui grande importância econômica para o Brasil por constituir um dos principais produtos de exportação do país. Os principais problemas relacionados à cultura do café são a ocorrência de estresses bióticos causados por pragas e doenças e estresses ambientais (hídrico, nutricional, etc). Recentemente, foi reportado o depauperamento de plantas de café causado por Xylella fastidiosa. Essa doença vem atingindo todas as regiões produtoras de café no país, causando perdas econômicas apreciáveis, principalmente para o estado de Minas Gerais que é um dos principais produtores desta cultura. O mecanismo de patogenicidade de Xylella fastidiosa ainda não é bem compreendido. A bactéria coloniza os vasos do xilema formando agregados que bloqueiam a passagem de água e nutrientes. Acredita-se que polissacarídeos e enzimas extracelulares tenham um papel importante na colonização dos vasos do xilema. Entretanto, os mecanismos de interação planta-patógeno não são conhecidos. Em 2001 foi iniciado um projeto para o sequenciamento de 200.000 ESTs de café em diferentes situações biológicas. O objetivo principal deste projeto é identificar genes que possam ser utilizados em programas de melhoramento da qualidade e competitividade do café. O presente trabalho teve por objetivo identificar genes expressos em plantas de café depauperadas com a presença de Xylella fastidiosa. Ramos de plantas de café apresentando os sintomas típicos relacionados a Xylella fastidiosa, como internodios curtos, presença de folhas pequenas em tufos, foram coletados. Uma análise preliminar em microscópio foi realizada para verificar a presença da bactéria nos feixes do xilema. Posteriormente, a presença de X. fastidiosa foi confirmada através de PCR utilizando DNA dos ramos e primers específicos para a bactéria. Uma biblioteca de cDNA foi construída a partir deste material vegetal e os resultados preliminares obtidos serão apresentados. Tentativas foram também realizadas para infiltrar a bactéria em radículas de café, uma vez que esta bactéria também já foi isolada de raízes de plantas depauperadas. A presença da bactéria nas radículas foi confirmada através de PCR com primers específicos 10 e 20 dias após a infiltração. Pretende-se analisar a expressão diferencial de radículas infiltradas e sadias na tentativa de se isolar genes relacionados a resposta da planta à presença de X. fastidiosa. Espera-se, com este projeto, que genes relacionados à interação de plantas de café com Xylella fastidiosa sejam identificados de maneira a contribuir em programas de melhoramento.Item Construção de bibliotecas de cDNA de diferentes fases da embriogênese somática em café(2003) Santos, Suzana Neiva; Tinoco, Maria Laine P.; Sá, Maíra Grossi de; Junqueira, Cristina Salgado; Soares, Alexandre F.; Andrade, Alan Carvalho; Teixeira, Joao Batista; Batista, João A. N.; Sá, Maria Fátima Grossi de; Silva, Felipe R. da; Borges, Carlos R.; Romano, Eduardo; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféEmbriogênese somática (ES) é reconhecida como uma ferramenta biotecnológica importante para regeneração e multiplicação de plantas economicamente importantes. Apesar de café ser uma cultura de alto valor comercial e ES ter sido estabelecida desde 1970, não existem estudos bioquímicos e moleculares que permitam compreender e controlar este processo nesta cultura. O racional deste trabalho é a comparação dos genes que são expressos em genótipos contrastantes (como Coffea arabica e C. canephora) em relação à competência embriogênica e em diferentes fases do processo de ES. Para atingir estes objetivos foram construídas bibliotecas de cDNA de C. arabica e C. canephora nas fases de: folha, folha induzida por 2,4-D, calo primário e calo embriogênico. Dez mil clones advindo destas bibliotecas estão sendo seqüenciados e analisados. A compreensão dos mecanismos que governam o processo de ES se constitui em uma ferramenta valiosa para o melhoramento convencional já que permite a multiplicação de indivíduos F1 advindos de programas de melhoramento. Por outro lado, o controle deste processo também será extremamente importante para introdução de características que aumentem a qualidade da cultura, através de engenharia genética.