SPCB - Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil
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Resultados da Pesquisa
Item Construção de uma biblioteca genômica de cromossomo artificial de bactéria de Coffea arabica(2007) Cação, Sandra Maria Bellodi; Diniz, Leandro Eugenio Cardamone; Silva, Nathalia V.; Veniky, Filipe; Andrade, Alan Carvalho; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Embrapa - CaféA produção de mapas físicos em plantas tem grande importância para estudos de genética e melhoramento. O passo inicial para produção destes mapas é a construção de bibliotecas genômicas com largos fragmentos de DNA, em vetores do tipo cromossomo artificial de bactéria (BAC) ou de levedura (YAC). Visando a produção de um mapa físico, o objetivo deste trabalho foi construir uma biblioteca genômica de BAC de café. Fragmentos de DNA de alto peso molecular de C. arabica híbrido de Timor cv. 832/2 foram clonados no vetor pCC1BAC e transformados em E. coli DH10B. Após transformação 57000 clones foram inicialmente obtidos e ordenados manualmente em placas de 96 poços. A biblioteca foi transferida em triplicata para placas de 384 poços, com equipamento Q-BOT, resultando em 55.778 clones em 148 placas. A verificação do tamanho do inserto de 130 clones revelou tamanho médio de 115-120 Kb. A cobertura do genoma haplóide estimada para C.arabica foi de cinco vezes. A validação da biblioteca presença de DNA de cloroplasto e mitocôndria, assim como a seleção inicial com sondas para iniciar o mapeamento físico, está sendo realizada através de hibridização de colônias em membranas contendo 18.462 clones em duplicata.Item Isolamento de um cDNA de catalase de café(2005) Diniz, Leandro Eugenio Cardamone; Sakiyama, Ney Sussumu; Noir, Sandra; Fernandez, Diana; Lashermes, Philippe; Embrapa - CaféUma biblioteca de cDNA de "Caturra" foi utilizada para se isolar fragmentos de genes associados à resistência, através da hibridização com sondas RGA. Após a utilização das nove famílias RGA de café, 32 colônias foram isoladas e seqüenciadas. Destas, 25 seqüências não apresentaram similaridade com outras seqüências disponíveis na base de dados do NCBI ou não puderam ser seqüenciadas. Seis amostras continham seqüências muito pequenas e não confiáveis, e apenas uma amostra resultou em uma seqüência de 428 nucleotídeos (142 aminoácidos). Esta seqüência apresentou alta homologia a catalases de outras plantas como Nicotiana plumbaginifolia, Glycine max, Phaseolus vulgaris, entre outras. A esta catalase descoberta em café foi dado o nome de Cat-C. A catalase de ligação ao ácido salicílico (SR1) e a seqüência parcial de aminoácidos da proteína de ligação ao ácido salicílico (SABP), ambos de N. tabacum, apresentaram 82% e 77% de identidade, respectivamente, quando comparadas a Cat-C. Na região C-terminal desta catalase foi detectada a presença de uma seqüência peroxissomal. No entanto, ao invés de uma seqüência SRL (Serina-Arginina-Leucina), foi encontrada uma seqüência TRL (Treonina-Arginina-Leucina). Esta diferença é devido à troca de uma timina por uma adenina. Estes dados sugerem que Cat-C pode estar associado ao mecanismo de resistência em café.Item Progressos no mapa de ligação gênica de Coffea arabica L. obtido com base em marcadores RAPD(2003) Oliveira, Antonio Carlos Baião de; Sakiyama, Ney Sussumu; Diniz, Leandro Eugenio Cardamone; Zambolim, Laércio; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféO desenvolvimento de mapas de ligação genética é uma das aplicações de maior importância da tecnologia dos marcadores moleculares no melhoramento de plantas, pois estes mapas permitem a geração de informações básicas a respeito da estrutura, organização e evolução do genoma, a localização das regiões genômicas que controlam características de importância agronômica, a quantificação do efeito destas regiões nos caracteres estudados, a decomposição de características complexas nos seus componentes mendelianos e a utilização de todas estas informações nos programas de melhoramento. O desenvolvimento de mapas de ligação saturados possibilita o teste de marcadores distribuídos por todo o genoma, aumentando a chance de se obter associações significativas com características de interesse. No caso de Coffea arabica L. (2n=4X=44), a construção de mapas de ligação tem sido dificultada em razão do baixo polimorfismo e de complicações advindas da poliploidia. Este trabalho se propôs a construir um mapa parcial de ligação gênica para Coffea arabica L., com base em marcadores RAPD, a partir de uma população segregante RC 1 de 59 plantas oriunda do cruzamento entre uma linhagem do Híbrido de Timor CIFC 2570 (UFV 445-46) e o cultivar Catuaí Amarelo IAC 30 (UFV 2143-235), este utilizado como genitor recorrente. Na identificação dos marcadores polimórficos, foram testados 1.200 primers da Operon Technologies (Kits OPA-OPZ, OPAA-OPAZ e OPBA-OPBH) e várias combinações aleatórias de pares de primers. A população segregante (RC 1 ) foi analisada pelos marcadores polimórficos consistentes, em que a banda polimórfica estava presente no genitor não-recorrente (Híbrido de Timor) e no F 1 e ausente no genitor recorrente (Catuaí). Os marcadores obtidos foram analisados pelo aplicativo GQMOL, utilizando, na construção do mapa, os marcadores que segregaram na proporção esperada de 1:1. Grupos de ligação foram estabelecidos pela análise de dois pontos, considerando-se a freqüência de recombinação máxima de 0,35 e o LOD escore mínimo de 3.0. Análises de três pontos e multipontos foram então utilizadas para encontrar a mais provável ordem dos marcadores dentro dos grupos de ligação e a função de Kosambi foi usada para conversão das taxas de recombinação em distâncias de mapa (cM – centiMorgan). Dos 1.200 primers de RAPD testados para a identificação de marcadores polimórficos entre os genitores e F 1 , 127 (10,6%) produziram fragmentos consistentes, presentes no Híbrido de Timor e no F 1 , mas ausentes no ‘Catuaí Amarelo’. Esses 127 primers informativos deram origem a 165 marcadores RAPD polimórficos (1,3 marcador por primer), dos quais 124 (75,15%) segregaram na proporção esperada de 1:1 e 41 (24,85%) exibiram desvio nesta segregação pelo teste Ç 2 (P>0,05). O nível de polimorfismo revelado pelas combinações de primers foi bem inferior (1,43%), pois das 698 combinações testadas, apenas dez foram polimórficas, em que sete destas apresentaram um único fragmento polimórfico e três, duas bandas polimórficas. Destes 13 marcadores, dez (76,9%) apresentaram segregação esperada de 1:1 e três (23,1%) mostraram desvio nessa proporção. Os 134 marcadores RAPD que segregaram na proporção esperada de 1:1, foram utilizados para a construção do mapa parcial de ligação. Dezessete destes marcadores não se mostraram ligados a nenhum dos grupos de ligação, enquanto os 117 marcadores restantes formaram 11 grupos de ligação, cobrindo 794,3 cM do genoma. O mapa apresentou boa distribuição dos marcadores nos grupos de ligação, nos quais a distância máxima entre dois marcadores foi de 26,93 cM no grupo 11, e apenas sete intervalos entre marcadores apresentaram distâncias acima de 20 cM. O número de grupos de ligação obtido foi bastante inferior ao correspondente número haplóide de cromossomos de Coffea arabica (n=22). Por essa razão, o genoma da espécie foi parcialmente explorado e muitas regiões ainda não foram identificadas. Outros tipos de marcadores moleculares, principalmente AFLP e SSR, devem ser incluídos, para melhorar a cobertura do genoma do cafeeiro, com a formação de novos grupos de ligação, inclusão dos marcadores não ligados e saturação dos intervalos nos grupos obtidos.Item Mapeamento físico detalhado do loco Mex-1 com clones BAC em café(2003) Diniz, Leandro Eugenio Cardamone; Noir, Sandra; Combes, Marie-Christine; Sakiyama, Ney Sussumu; Lashermes, Philippe; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféO nematóide da espécie Meloidogyne exigua parasita o café (Coffea arabica L.) e sua erradicação das regiões infestadas é impraticável. Estudos anteriores mostraram que a resistência a M. exigua é controlado por um gene de herança simples, designado Mex-1 presente na espécie C. canephora. Linhagens de café arábica apresentando resistência têm sido desenvolvidas em alguns programas de melhoramento por meio da introgressão deste gene. O estudo da forma de introgressão do gene Mex-1 de C. canephora em C. arabica, pode dar a oportunidade de melhor entendimento da genética da resistência. Muitos estudos têm demonstrado que bibliotecas BAC são bem apropriadas para a clonagem baseada em mapa e para o mapeamento físico. O desenvolvimento desta biblioteca (BAC) permite acelerar o mapeamento do gene Mex-1. A biblioteca BAC de café foi avaliada com 3 marcadores ligados a Mex-1, obtidas a partir de marcadores AFLP clonados. A partir destes marcadores, Exi-2, Exi-3 e Exi-4, foram identificados 5, 11 e 2 clones positivos, respectivamente. Os 18 clones positivos associados à região Mex-1 foram identificados e isolados. Estes marcadores moleculares flanqueando Mex-1 foram reunidos em 3 regiões de contig. O tamanho dos insertos variou entre 130 e 250 kb. Os clones BAC Exi-2 e Exi-3 foram, respectivamente, separados em 2 contigs homeólogos. Isto é consistente com a estrutura alotetraplóide de C. arabica. Cada contig homeólogo está contido em um dos 2 subgenomas de C. arabica. Além disso, a distinção de apenas 2 contigs homeólogos sugere que o fragmento introgredido levando Mex-1 é o resultado de uma recombinação homóloga entre os genomas de C. canephora e um dos dois subgenomas de C. arabica. Estes clones BAC foram analisados por fingerprinting e seus padrões de bandas foram comparados. O DNA dos clones foi então analisado por hibridação e amplificação com SCAR (Exi-2 e Exi-3) e 9 combinações de primers das extremidades BAC (3A-T7, 3B-T7, 3B-SP6, 3G-T7, 3H-T7, 3K-T7, 4A-T7, 4A-SP6 e 4B-T7) foram também utilizados. Os clones BAC positivos, relativos aos marcadores Exi-2, Exi-3 e Exi-4, foram reunidos em 5 contigs. O primeiro contig aparece composto de dois clones BAC positivos com o marcador Exi-4. O padrão de fingerprinting destes clones mostrou forte semelhança, apresentando também o mesmo perfil RFLP com a sonda 4B-T7. Dos cinco clones BAC identificados com o marcador Exi-2, dois contigs designados Exi-2 I e Exi-2 II foram distintos. O primeiro consiste nos BAC 2B e 2E, enquanto o segundo dos BAC 2A, 2C e 2D. Os clones BAC positivos Exi-3 estão organizados em dois contigs distintos chamados Exi-3 I e Exi-3 II. No total, nove sítios de restrição ou PCR, correspondentes a sete marcadores físicos (seqüências identificadas por hibridação ou PCR) foram localizados na região Exi-3. Baseado nos seis marcadores físicos compartilhados pelos dois contigs, foi observada uma certa colinearidade nestes contigs. Não havia nenhuma diferença discernível na posição dos marcadores entre os dois contigs Exi-3. Apesar disso, os dois contigs homeólogos mostraram diferenças significativas. As três regiões cromossômicas correspondentes ao contig Exi-4, os dois contigs Exi-2 e os dois contigs Exi-3 não apresentaram nenhuma sobreposição. Como esperado para a estrutura alotetraplóide de C. arabica, contigs homeólogos foram identificados. Além disso, a presença dentro da região Mex-1 de clones BAC contendo genes análogos de resistência (RGAs) foi investigado por amplificação, utilizando para isso, primers degenerados e hibridação com sondas RGA de café. Clones BAC positivos foram identificados para várias famílias de RGA. A região Mex-1 parece formar um complexo agrupamento de genes de resistência.Item O uso de RAPD associado a enzimas de restrição para detectar variabilidade genética no banco de germoplasma de Coffea arabica L. do IAPAR(2000) Diniz, Leandro Eugenio Cardamone; Ruas, Paulo Maurício; Ruas, Claudete de Fátima; Sera, Tumoru; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféA variabilidade genética existente entre 40 acessos de Coffea arabica foi avaliada utilizando RAPD associado a uma pré-digestão do DNA genômico com endonucleases de restrição. Os acessos analisados fazem parte da coleção de Coffea mantida no Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR). A variabilidade genética e a relação entre os acessos foram analisadas utilizando 184 primers. Entretanto, nenhum polimorfismo ou baixo nível de bandas polimórficas foi observada em cada primer. Para melhorar a eficiência na detecção do polimorfismo, o DNA genômico de todos os acessos foi submetido à digestão com enzimas de restrição antes da amplificação. Treze primers utilizados associados ou não às enzimas de restrição, que sugeriram polimorfismo, foram selecionados. Um dendrograma foi construído utilizando o agrupamento UPGMA. Um total de 236 produtos de amplificação foi obtido, com 216 bandas polimórficas (91,5%). Os resultados mostraram a utilidade das enzimas de restrição para estimar a relação genética dos acessos de C. arabica.