SPCB - Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil
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Resultados da Pesquisa
Item Produção de plantas transgênicas de café resistentes ao herbicida glufosinato de amônio(2005) Ribas, Alessandra Ferreira; Kobayashi, Adilson Kenji; Pereira, Luiz Felipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Embrapa - CaféPlantas transgênicas de Coffea canephora P. resistentes ao herbicida glufosinato de amônio foram regeneradas a partir de explantes foliares co-cultivados com Agrobacterium tumefaciens EHA105 contendo o plasmídio pCAMBIA3301, que contém os genes bar e uidA ambos sob controle do promotor 35S ou pIBI3 (3300 contendo o gene da ACC oxidase, antisenso) ou ainda bombardeados com o plasmídio pCAMBIA3301. Embriogênese somática direta foi induzida no meio contendo ¼ dos macros e metade dos micronutrientes do meio MS, constituintes orgânicos do meio B5 e 30 g.L-1 de sacarose, suplementado com 5mM N6 - (2-isopentenil)adenina (2-iP) e 10 mM de glufosinato de amônio para seleção de embriões transgênicos putativos. A presença e a integração do gene bar foram confirmados pelas análises de PCR e Southern blot. As plantas transgênicas pulverizadas com 1600 mg.L-1 do herbicida Finale que contém glufosinato como ingrediente ativo, não apresentaram sintomas de toxidez, mantiveram a coloração e continuaram crescendo normalmente na aclimatação ex vitro.Item Transformação genética de Coffea canephora mediada por Agrobacterium tumefaciens com gene heterólogo de ACC-oxidase na orientação anti-senso(2003) Ribas, Alessandra Ferreira; Kobayashi, Adilson Kenji; Cação, Sandra Maria Bellodi; Pereira, Luiz Felipe Protasio; Ayub, Ricardo Antônio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféO fitorregulador etileno está associado a vários eventos fisiológicos em plantas. Em frutos climatéricos, um aumento dramático na síntese de etileno promove os passos subseqüentes do amadurecimento. Uma das alternativas para obtenção de plantas com maturação uniforme é o controle da síntese do fitorregulador etileno, pode ser feito através da transformação genética de plantas com genes da sua rota metabólica em orientação anti-senso. A enzima ACC oxidase, que catabolisa o último passo da biossíntese deste fitoregulador, tem sido um dos alvos preferidos para inibição com genes anti-senso, com uma conseqüente redução na produção de etileno. O objetivo deste trabalho foi introduzir o gene da ACC-oxidase do melão em plantas de C. canephora P. via Agrobacterium tumefaciens, usando o herbicida glufosinato de amônio como agente seletivo. Explantes de C. canephora foram cultivados em meio para indução de embriogênese direta ED (1/4 macro e 1/ 2 dos micronutrientes do meio MS, vitaminas do meio B 5 , 30 g.L -1 de sacarose, 100 mg.L -1 de cisteína), suplementados com 5 mM de 2-iP por três semanas. Os explantes foram imersos em suspensão de Agrobacterium tumefaciens EHA105 contendo o plasmídio pIBI3 que contém os genes da fosfinotricina acetiltransferase (bar) e da ACC-oxidase do melão na orientação anti-senso. Os explantes foram submetidos à sonicação por 2 segundos, sendo em seguida transferidos para meio ED e co-cultivados por 4 dias a 24° C no escuro. Após este período, os explantes foram transferidos para meio ED fresco contendo 10 mM de glufosinato e 400 mg.L -1 de cefotaxima. Inicialmente, 87 explantes foram co-cultivados e produziram 18 calos embriogênicos resistentes ao glufosinato quatro meses após a infecção. Embriões transgênicos putativos foram transferidos para meio ED sem fitoreguladores para permitir germinação. As plântulas provenientes de cinco eventos independentes foram aclimatadas em casa-de-vegetação. A análise de PCR confirmou a presença de fragmentos amplificados do gene bar (516 pb) em 44 das 62 plantas analisadas. Em plantas controle (não transformadas) nenhuma amplificação foi observada. A análise de Southern blot foi conduzida para avaliar a integração do gene da ACC oxidase de melão em plantas de C. canephora P. Os resultados demonstraram a presença do transgene em todas as seis plantas analisadas. A dupla digestão com as enzimas de restrição EcoR I e Hind III, liberou um fragmento de aproximadamente 1200 pb que hibridizou com a sonda correspondente ao transgene. Plantas transformadas e plantas controle foram pulverizadas com 1% (v/v) de uma formulação comercial de herbicida (Finale, AgrEvo â ) contendo 20% de glufosinato de amônio. Plantas controle demonstraram os primeiros sintomas de intoxicação 48 h após a pulverização devido a acumulação de amônia nos tecidos, e uma semana após as plantas estavam totalmente necrosadas. Nas plantas transformadas nenhum sintoma foi observado. As plantas estão em fase de crescimento em casa-de-vegetação. A determinação da produção de etileno será realizada, através de cromatografia gasosa, quando as plantas iniciarem a frutificação.Item Identificação e caracterização de genes de poligalacturonase de Coffea arabica(2003) Cação, Sandra Maria Bellodi; Galvão, Rafaelo Marques; Pereira, Luiz Felipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféAs poligalacturonases (EC 3.2.1.15, PG) são responsáveis pela degradação dos ácidos poligalacturônicos da parede celular, contribuindo para desassociação celular. Durante a maturação dos frutos, as poligalacturonases estão envolvidas na solubilização e na despolimerização da pectina aumentando a maciez do fruto. As poligalacturonases também participam de outros processos fisiológicos onde ocorre a separação de células como a abscisão e deiscência, germinação do pólen, formação do tubo polínico e resposta a estresses bióticos. A caracterização de genes de poligalacturonases possibilitará um maior entendimento do padrão de expressão deste gene e do funcionamento da enzima, podendo ser o ponto de partida para aplicações quanto à qualidade do café. Portanto este trabalho tem como objetivo a identificação e caracterização de genes de poligalacturonase de Coffea arabica que, subseqüentemente, serão utilizados para experimentos de transformação genética visando o controle do amadurecimento de frutos. Oligonucleotídeos foram desenhados baseados no alinhamento de seqüências conservadas de genes da poligalacturonase do banco de dados GeneBank. A reação de PCR foi conduzida utilizando DNA total de C. arabica, os produtos amplificados foram eluídos do gel de agarose e clonados no vetor pCR â 2.1-TOPO utilizando o Kit de clonagem TOPO TA Cloning â (Invitrogen). Clones contendo um fragmento de 600pb foram selecionados para o seqüenciamento. As seqüências foram analisadas utilizando o programa BLASTN, apresentando homologia com as seqüências de poligalacturonase de Lycopersicon esculetum, Cucumis melo e Nicotiana tabacum. Alguns clones também apresentaram alta homologia a ESTs do banco de dados do Projeto Genoma Café (http://arara.lbi.ic.unicamp/café/). Atualmente, estão sendo realizadas análises de Southern blot para verificar o número de cópias nas principais espécies de Coffea e análise de Northern blot para verificar a expressão da poligalacturonase em diferentes tecidos e estádios de maturação de frutos.Item Caracterização molecular de enzimas chave do metabolismo de açúcares em café(2003) Ferreira, Lúcia P.; Geromel, Clara; Cavalari, Aline A.; Marraccini, Pierre Roger Rene; Mazzafera, Paulo; Pereira, Luiz Felipe Protasio; Vieira, Luis Gonzaga E.; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféNas sementes de café, os carboidratos representam metade da massa seca e participam de extensivas alterações químicas que ocorrem durante a torração da semente. Dentre estes, a sacarose é considerada um dos principais precursores do sabor e do aroma devido a sua rápida degradação, que leva à glicose e à frutose. A quebra da sacarose durante a torração leva à formação de anidro-açúcares (tais como 1,6 anidro-glicose, arabinose e glioxal). Estes, por sua vez, reagem de várias maneiras levando à formação de vários de compostos (ácidos alifáticos, pirazina, compostos carbonílicos, hidroximetil furfural e outros furanos). Apesar disso, muito pouco é conhecido sobre o metabolismo de açúcares em café, particularmente durante a longa fase do desenvolvimento da semente. Desta forma, o objetivo do presente trabalho é compreender melhor o metabolismo de açúcares na semente de café, principalmente o que se refere às relações fonte-dreno durante o seu desenvolvimento e como isto afetará o tamanho da semente. Para atingir estes objetivos, estão sendo utilizadas seqüências de cDNA de invertase (EC 3.2.1.26), sacarose fosfato sintase (EC 2.4.1.14) e sacarose sintase (EC 2.4.1.13) clonadas em nossos laboratórios, ou seqüências provenientes do Projeto Genoma Café (http:// arara.lbi.ic.unicamp.br/cafe/). Os dados sobre o uso dessas seqüências para investigar a expressão durante o desenvolvimento da semente serão apresentados, assim como aqueles relativos a experimentos em que ramos contendo frutos receberam 14 CO2, além da distribuição da radioatividade determinada nos diferentes tecidos dos frutos. As atividades de invertase e sacarose sintase também estão sendo estudadas em folhas de diferentes idades assim como nos diferentes tecidos do fruto.Item Thidiazuron como indutor de embriogênese somática em café (Coffea canephora Pierre)(2000) Kobayashi, Adilson Kenji; Pereira, Luiz Felipe Protasio; Bespalhok, Carlos; Ribas, Alessandra Ferreira; Galvão, Rafaelo Marques; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféOs efeitos de thidiazuron (TDZ) na indução de embriogênese somática em Coffea canephora foi investigado. Explantes foliares de C. canephora foram cultivados em um meio de cultura suplementado com diferentes concentrações de TDZ. Embriões somáticos foram observados nas concentrações de 0,25 até 2 mM, após dois meses em cultivo. Dentre os tratamentos testados, TDZ a 1 mM mostrou a mais alta freqüência de explantes com regeneração e maior número de embriões por explante. Entretanto, a indução de embriogênese somática ocorreu de forma não-sincronizada com todos os tratamentos investigados apresentando embriões em diferentes estádios de desenvolvimento.