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Item Caracterização patogênica de isolados de Colletotrichum spp. obtidos de cafeeiro e outras culturas no estado do Paraná(2007) Rampazo, Luís Gustavo; Marçal, Viviani Vieira Marques; Leite, Rui Pereira; Embrapa - CaféA interação Colletotrichum-cafeeiro tem atraído a atenção de diferentes grupos de pesquisa no Brasil. A susceptibilidade entre cultivares e testes de patogenicidade cruzada em diferentes hospedeiros são empregados para caracterização patogência dos isolados. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a patogenicidade de isolados de Colletotrichum spp. de cafeeiros e outras plantas cultivadas pela inoculação de frutos verdes de diferentes cultivares de Coffea arabica L. Dez dias após a inoculação, lesões típicas de antracnose foram observadas nos frutos de todos os cultivares de cafeeiro usados, principalmente quando inoculados com o isolado I-12 de C. gloeosporioides. O cultivar Semperflorens mostrou-se o mais susceptível, apresentando até 100% de frutos com lesões. Com o cultivar Catuaí Arrepiado foi possível verificar a ocorrência de uma provável especialização patogênica, pois somente os isolados obtidos de cafeeiro foram capazes de induzir lesões nos frutos deste cultivar. A incidência de frutos com lesões sob inoculação artificial obtida neste estudo foi até mais elevada que as anteriormente descritas na literatura. Entretanto, testes com outros cultivares de cafeeiro e isolados de Colletotrichum spp. de diferentes culturas devem ser realizados para a melhor compreensão da especialização patogênica entre estes. e seus diferentes hospedeiros.Item Comparação genética entre isolados de Colletotrichum spp. provenientes de cafeeiro e outras plantas cultivadas por meio de PCR/RFLP(2007) Marçal, Viviani Vieira Marques; Rampazo, Luís Gustavo; Silva, Michele Regina Lopes da; Gonçalves, Juliana S.; Campos, Vanessa B.; Pacolla-Meirelles, Luzia D.; Leite, Rui Pereira; Embrapa - CaféA variabilidade genética de isolados de Colletotrichum spp. obtidos de cafeeiro e de outras plantas cultivadas foi estimada através da técnica de PCR/RFLP, usando primers específicos para a amplificação das regiões transcritas internas (ITS1 e ITS2) do DNA ribossomal. O produto de PCR foi digerido com enzimas e as relações entre os perfis genômicos foram analisadas com o programa NTSYS pelo método Dice/UPGMA. Os resultados obtidos permitiram dividir os isolados em dois grupos, de acordo com os isolados padrões de Colletotrichum gloeosporioides e Colletotrichum acutatum utilizados para fins comparativos. Entre os doze isolados obtidos de cafeeiro, nove apresentaram 100% de similaridade entre si e todos eles apresentaram elevada similaridade com C. gloeosporioides. Em relação aos isolados de outras plantas cultivadas, cinco dos treze isolados apresentaram similaridade com o C. acutatum. Para a maioria destes isolados, não foi possível correlacionar caracteres morfológicos, perfis genéticos e o hospedeiro de origem. Neste sentido, novas técnicas moleculares devem ser aplicadas no estudo de isolados de Colletotrichum spp.Item Caracterização de Colletotrichum spp. associado ao cafeeiro no Estado do Paraná(2005) Silva, Michele Regina Lopes da; Meneguim, Luciana; Gonçalves, Juliana S.; Pistori, Juliana F.; Leite, Rui Pereira; Embrapa - CaféNo Brasil, existem diversos relatos da ocorrência de doenças em cafeeiro associadas a fungos do gênero Colletotrichum, como antracnose, seca-de-ramos, queda-de-frutos, seca-de-frutos e mancha-manteigosa. Entretanto, a falta de estudos mais detalhados sobre as características de Colletotrichum spp. que ocorrem em cafeeiro no Brasil e das doenças que eles realmente causam tem gerado dúvidas a respeito da patogenicidade desses fungos para cafeeiro e dos danos que podem causar para a cultura. Estudos foram realizados com os objetivos de obter informações sobre a identidade e características deste organismo. Os resultados obtidos nos estudo de caracterização de Colletotrichum spp. associados ao cafeeiro indicam que espécies desse fungo estão presentes em necroses em folhas, ramos e frutos de cafeeiro de diferentes cultivares nas diversas regiões produtoras do Estado do Paraná. O exame de mais de 400 isolados revelaram que a única espécie presente em cafeeiro é C. gloeosporioides, sendo que para pouco mais de 5% dos isolados foi também constatada a forma perfeita Glomerella cingulata. Estudos adicionais devem ser conduzidos para determinar a patogenicidade desse fungo para cafeeiro, e sua capacidade de infectar diferentes partes da planta, como também determinar a possibilidade de outras espécies de Colletotrichum estarem associadas ao cafeeiro no ParanáItem Expressão de genes em ramos de café depauperado com a presença de Xylella fastidiosa(2003) Mehta, Angela; Oliveira, Angélica C. de; Eira, Mírian T. S.; Leite, Rui Pereira; Andrade, Alan Carvalho; Silva, Felipe R. da; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféA cultura do café possui grande importância econômica para o Brasil por constituir um dos principais produtos de exportação do país. Os principais problemas relacionados à cultura do café são a ocorrência de estresses bióticos causados por pragas e doenças e estresses ambientais (hídrico, nutricional, etc). Recentemente, foi reportado o depauperamento de plantas de café causado por Xylella fastidiosa. Essa doença vem atingindo todas as regiões produtoras de café no país, causando perdas econômicas apreciáveis, principalmente para o estado de Minas Gerais que é um dos principais produtores desta cultura. O mecanismo de patogenicidade de Xylella fastidiosa ainda não é bem compreendido. A bactéria coloniza os vasos do xilema formando agregados que bloqueiam a passagem de água e nutrientes. Acredita-se que polissacarídeos e enzimas extracelulares tenham um papel importante na colonização dos vasos do xilema. Entretanto, os mecanismos de interação planta-patógeno não são conhecidos. Em 2001 foi iniciado um projeto para o sequenciamento de 200.000 ESTs de café em diferentes situações biológicas. O objetivo principal deste projeto é identificar genes que possam ser utilizados em programas de melhoramento da qualidade e competitividade do café. O presente trabalho teve por objetivo identificar genes expressos em plantas de café depauperadas com a presença de Xylella fastidiosa. Ramos de plantas de café apresentando os sintomas típicos relacionados a Xylella fastidiosa, como internodios curtos, presença de folhas pequenas em tufos, foram coletados. Uma análise preliminar em microscópio foi realizada para verificar a presença da bactéria nos feixes do xilema. Posteriormente, a presença de X. fastidiosa foi confirmada através de PCR utilizando DNA dos ramos e primers específicos para a bactéria. Uma biblioteca de cDNA foi construída a partir deste material vegetal e os resultados preliminares obtidos serão apresentados. Tentativas foram também realizadas para infiltrar a bactéria em radículas de café, uma vez que esta bactéria também já foi isolada de raízes de plantas depauperadas. A presença da bactéria nas radículas foi confirmada através de PCR com primers específicos 10 e 20 dias após a infiltração. Pretende-se analisar a expressão diferencial de radículas infiltradas e sadias na tentativa de se isolar genes relacionados a resposta da planta à presença de X. fastidiosa. Espera-se, com este projeto, que genes relacionados à interação de plantas de café com Xylella fastidiosa sejam identificados de maneira a contribuir em programas de melhoramento.Item Presença de Xylella fastidiosa em quatro espécies de cigarrinhas da família cicadellidae coletadas em viveiros de café no estado do Paraná(2003) Paião, F. G.; Novaes, Tanara G. de; Rossini, Viviane; Motomura, Karina F.; Lovato, Lidiana; Meneguim, Ana Maria; Leite, Rui Pereira; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféXylella fastidiosa é uma bactéria fitopatogênica, gram-negativa, que causa doenças em diversas plantas cultivadas de importância econômica. É responsável pelo mal de pierce em videira, clorose variegada dos citros (cvc), nanismo do pessegueiro e requeima das folhas de cafeeiro, dentre outras. Essa bactéria é transmitida por insetos sugadores do xilema, como cigarrinhas e cigarras das famílias Cicadellidae e Cicadidae, respectivamente. Indivíduos da família Cicadellidae das espécies Bucephalogonia xanthophis, Dilobopterus costalimai, Oncometopia fascialis e Sonesimia grossa, já descritas como transmissoras para citros, foram capturadas em viveiros de café nos municípios de Abatiá, Iporã e Jandaia do Sul, PR, e avaliadas quanto à presença de X. fastidiosa. As coletas dos insetos foram realizadas no período de outubro de 1998 a setembro de 2001. Um total de 236 amostras de cigarrinhas, contendo de três a cinco cibários, foram submetidas à extração de DNA, e aos testes de pcr (reação de polimerase em cadeia) e nested pcr, utilizando os primers rst31 e rst33 e rst31-interno e rst33-interno, respectivamente, específicos para X. fastidiosa. A bactéria foi detectada nas quatro espécies de cigarrinhas, com porcentagem de presença nas amostras de 6,5% em D. costalimai, 19% em S. grossa, 24% em O. fascialis e 30% em B. xanthophis. Enquanto que em indivíduos das espécies B. xanthophis e O. fascialis a bactéria foi detectada praticamente todos os meses, durante o período de amostragem nos viveiros de Abatiá e Iporã, em D. costalimai foi constatada somente no mês de abril de 2001 em indivíduos coletados no viveiro de Abatiá. A presença da bactéria foi verificada em 20 e 29% das amostras de cigarrinhas de viveiros dos municípios de Abatiá e Iporã, respectivamente. Em contraste, X. fastidiosa não foi constatada nas amostras de cigarrinhas provenientes de viveiro do município de Jandaia do Sul.Item Levantamento de espécies de cigarras e transmissão de Xylella fastidiosa em cafeeiro(2003) Paião, Fernanda; Meneguim, Ana Maria; Casagrande, Elaine C.; Lovato, Lidiana; Leite, Rui Pereira; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféHomópteros que se alimentam do xilema das plantas são vetores potenciais da bactéria Xylella fastidiosa, responsável por diversas doenças em plantas cultivadas como a requeima em cafeeiro. Em lavouras de café, cigarras (Homoptera: Cicadidae), sugadoras de xilema, ocorrem com freqüência e são vetores potenciais de X. fastidiosa. Assim, este trabalho teve por objetivo identificar as espécies de cigarras que ocorrem em lavouras comerciais de café em diferentes regiões do Estado do Paraná, detectar a presença e avaliar o potencial de transmissão de X. fastidiosa pelas espécies coletadas. As amostragens foram realizadas nos municípios de Paranavaí, Mandaguari, Rolândia, Londrina e Ribeirão do Pinhal, PR, no período de novembro de 1998 a outubro de 2001. Os espécimes coletados foram identificados e submetidos ao teste de PCR (reação de polimerase em cadeia) e nested PCR, utilizando os primers RST31 e RST33 e RST31-interno e RST33-interno, respectivamente, para detecção da bactéria X. fastidiosa. Para avaliar a transmissão de X. fastidiosa, 20 a 30 cigarras da espécie Dorisiana virides e de uma espécie de Cicadidae não identificada foram confinadas em gaiolas contendo mudas de cafeeiro cultivar IAPAR 59 (Coffea arabica) sem acento) por três dias. As mudas foram mantidas para observação de sintomas da doença e detecção da bactéria em câmara de crescimento de plantas por um período de seis meses. As espécies identificadas foram: D. drewseni, D. virides, Carineta matura, Carineta sp. e uma espécie de Cicadidae não identificada. Todas as espécies apresentaram resultado positivo para presença da bactéria X. fastidiosa pelo teste de nested PCR. A maior porcentagem de cigarras carregando a bactéria foi da espécie D. drewseni, com 35% de amostras positivas, coletadas no município de Paranavaí. Somente para a espécie C. matura proveniente do município de Mandaguari a bactéria não foi detectada. X. fastidiosa foi detectada por PCR em quatro das 101 plantas de café submetidas ao teste de transmissão por cigarras após seis meses.Item Detecção de Xylella fastidiosa em Cicadelíneos coletados em lavouras cafeeiras no estado do Paraná(2003) Paião, Fernanda; Novaes, Tanara G. de; Motomura, Karina F.; Rossini, Viviane; Meneguim, Ana Maria; Lovato, Lidiana; Leite, Rui Pereira; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféA bactéria Xylella fastidiosa, responsável pela doença requeima do cafeeiro, é transmitida naturalmente por cigarrinhas sugadoras do xilema das plantas. Homópteros pertencentes às famílias Cercopidae, Cicadidae e Cicadellidae são considerados potenciais vetores da bactéria. Assim, o objetivo deste trabalho foi identificar os vetores da bactéria entre as espécies mais freqüentes pertencentes à sub família Cicadellinae coletadas nas principais regiões cafeeiras do Estado do Paraná. Foram realizadas amostragens quinzenais, através de armadilha adesiva amarela e rede entomológica, em lavouras comerciais localizadas nos municípios de Londri-na, Paranavaí, Mandaguari, Ribeirão do Pinhal e Altônia, PR, durante o período de novembro de 1998 a outubro de 2001. Através da identificação taxonômica, os insetos foram agrupados em famílias e subfamílias, e os cicadelíneos coletados em maior freqüência foram submetidos ao teste de PCR (reação de polimerase em cadeia) e nested PCR, utilizando os primers RST31 e RST33 e RST31-interno e RST33-interno, respectivamen-te, para detecção da bactéria X. fastidiosa. Oito espécies de cicadelíneos foram mais freqüentes, sendo elas: Acrogonia citrina, Bucephalogonia xanthophis, Dilobopterus costalimai, Oncometopia fascialis, Macugonalia cavifrons, Molomea consolida, Scopogonalia subolivaceae e uma espécie pertencente a um taxon novo, Neosonia sp.. Do total de 232 amostras submetidas ao teste de PCR, 31% delas apresentaram resultado positivo para a presença de X. fastidiosa, sendo detectada em seis das oito espécies avaliadas. Dentre as espécies, S. subolivaceae apresentou o maior índice de detecção (77%), enquanto que, a espécie M. consolida apresentou o menor índice (5%). A espécie O. fascialis e a do taxon novo, Neosonia sp., apresentaram resultados negati-vos para a presença de X. fastidiosa. Com relação ao período de amostragem, a maior ocorrência da bactéria foi determinada no período de novembro de 2000 a outubro de 2001, onde 44% das amostras foram positi-vas. Na população de cicadelíneos do município de Paranavaí foi observada a maior porcentagem de detecção (48%), apresentando os maiores índices de presença da bactéria durante todo o período. Nesse local, foram coletados indivíduos com a bactéria nos três anos de amostragem, porém isto não foi observado nos demais municípios.Item Diversidade genética de isolados de Xylella fastidiosa de cafeeiros por eletroforese de campo pulsado(2003) Nunes, Liliane Moreira; Meneguim, Luciana; Casagrande, Elaine C.; Leite, Rui Pereira; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféXylella fastidiosa é uma bactéria fitopatogênica responsável por perdas consideráveis em diversas culturas de importância econômica, causando doenças como a clorose variegada dos citros (CVC), mal de Pierce em videira e escaldadura das folhas em diversas outras plantas. Em cafeeiro (Coffea arabica), o primeiro relato da ocorrência desta bactéria foi no Estado de São Paulo em 1995. Plantas infectadas apresentavam sintomas de depauperamento generalizado e ramos com internódios curtos. Devido à importância deste patógeno, o presente trabalho visou a caracterização molecular de isolados de X. fastidiosa obtidos de cafeeiro, pela análise de perfis genômicos por eletroforese de campo pulsado ("pulsed-field"). Neste estudo foram incluídos isolados das regiões Norte, Norte Pioneiro, Noroeste e Oeste do Estado do Paraná. Os perfis genômicos foram obtidos pela digestão do genoma bacteriano com a endonuclease de restrição Swa I. Com base nos perfis obtidos foi construída uma matriz binária de presença (1) e ausência (0) de fragmentos de DNA. Para calcular os índices de similaridade entre os pares de genótipos foi utilizado o coeficiente de Nei & Li (1979). Pelo menos seis perfis genômicos distintos foram encontrados entre os isolados de X. fastidiosa provenientes de diferentes regiões cafeeiras do Paraná. A similaridade genética entre os isolados bacterianos variou de 0,66 a 1,00. Foram observados cinco perfis genômicos diferentes entre os isolados da região Noroeste do Paraná. Por outro lado, os perfis genômicos obtidos para os isolados das regiões Norte, Norte Pioneiro e Oeste foram mais uniformes.Item Otimização da técnica de PCR para detecção de Xylella fastidiosa em insetos vetores associados a cafeeiro(2001) Paião, F. G.; Meneguim, Ana Maria; Leite, Rui Pereira; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféXylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa limitada ao xilema, que causa doenças em várias plantas de interesse econômico. No Brasil, foi relatada causando escaldadura da folha de ameixeira, clorose variegada dos citros (CVC) e depauperamento em cafeeiro. O principal meio de transmissão desta bactéria ocorre através de insetos sugadores do xilema. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) para detecção de X. fastidiosa em insetos vetores. Cigarrinhas coletadas em cafezais no Paraná tiveram o DNA total extraído segundo os métodos propostos por Vega et al. (1993), Cheung et al. (1993) e pela extração utilizando a resina CHELEX 100. Devido à baixa sensibilidade apresentada pelo PCR, foi desenvolvido o nested-PCR. Esta técnica envolve inicialmente a amplificação de fragmento de DNA, utilizando primeiramente um par de "primers", e a seguir o produto deste PCR serve como molde para uma segunda amplificação usando um novo conjunto de "primers", internos à seqüência amplificada no primeiro PCR. Os "primers" utilizados para amplificar o DNA de X. fastidiosa presente em cigarrinhas foram: 272-1 e 272-2 e RST31-RST33, para o primeiro PCR; e CVC-1 e 272-2 interno e RST31-RST33 internos, para o segundo PCR (nested PCR). O nested-PCR mostrou-se mais sensível e específico, utilizando os "primers" RST31-RST33 no primeiro PCR e RST31-RST33 internos no segundo PCR, para detecção de X. fastidiosa em cigarrinhas.Item Estudo de hospedeiros alternativos de Xylella fastidiosa associada a Coffea spp.(2001) Nunes, D. H.; Carvalho, Flávia Maria de Souza; Paião, F. G.; Meneguim, Luciana; Leite, Rui Pereira; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféO café (Coffea arabica) é largamente cultivado no Brasil. A escaldadura da folha do café causada por Xylella fastidiosa tem sido associada a grandes prejuízos à cafeicultura. X. fastidiosa é uma bactéria Gram-negativa limitada ao xilema de plantas, transmitida por insetos vetores. Cafeeiros infectados podem apresentar sintomas como redução de porte e folhas de tamanho reduzido e cloróticas. O objetivo deste estudo foi identificar espécies de plantas invasoras de lavouras cafeeiras e plantas cultivadas que possam ser hospedeiras alternativas da bactéria. Foram semeadas e inoculadas 32 espécies diferentes em casa de vegetação, no IAPAR, Londrina-PR. Para inoculação, foram utilizadas suspensões dos isolados 12762, 12726, 12781, 12968 e 12373 de X. fastidiosa. As plantas foram inoculadas pelo método de perfuração com alfinete e enxertia e acompanhadas periodicamente, para verificar a manifestação de sintomas. Também foram coletadas plantas de Arachis pintoi, na Estação Experimental do IAPAR, Paranavaí-PR. As espécies inoculadas foram submetidas aos testes de PCR ("polymerase chain reaction") e DAS-ELISA ("double antibody sandwich" - "enzyme-linked assay"), para detecção da bactéria. Na espécie A. pintoi foi realizado somente o teste de DAS-ELISA. Pelo teste de PCR não foi identificada nenhuma espécie de planta hospedeira da bactéria. Pelo teste de DAS-ELISA foram identificadas como potenciais hospedeiras alternativas de X. fastidiosa as espécies A. pintoi, N. tabacum - TNN, N. clevelandii, N. turkishin, Brachiaria decumbens e Catharanthus roseus. Nenhuma das espécies inoculadas apresentou sintomas característicos de infecção por X. fastidiosa.