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Item Construção de macroarranjos de cDNA de café, para a identificação de genes de interesse agronômico(2007) Vinecky, Felipe; Vieira, Natália G.; Ferreira, Daniela L.A.; Freire, Luciana P.; Marraccini, Pierre Roger Rene; Silva, Felipe R. da; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - CaféPara a construção dos macroarranjos, foi gerado inicialmente um conjunto não redundante de clones (Unigene), resultante da análise do banco de dados gerado no projeto Genoma Café. Utilizando-se um sistema automatizado para o rearranjo (Q-Bot), um conjunto não redundante com aproximadamente 33 mil clones foi rearranjado, perfazendo um total de 86 placas de 384 poços. O DNA plasmidial de todo esse conjunto de clones (33 mil), foi extraído e amostras representativas de cada uma das placas foi analisada por eletroforese em gel de agarose. Com o objetivo de se ter uma idéia do resultado do rearranjo, 4 clones aleatórios (1 clone/ quadrante de 96) de cada placa de 384 foram seqüenciados e comparados por análises de BlastN na Base de Dados do Genoma Café, para a confirmação da identidade dos clones. Do total de seqüências analisado, verificou-se uma porcentagem de 8% de erros ocorridos no rearranjo. Essas placas foram rearranjadas e amostras, novamente seqüenciadas. Após essa etapa, as membranas serão construídas e o presente trabalho teve como objetivo, avaliar a metodologia para a construção de macroarranjos, em escala piloto, para se determinar as melhores condições para a impressão de DNA nas membranas do Unigene Café. Foram avaliados os parâmetros, tipo de DNA a ser impresso (DNA plasmidial vs. Produto de PCR) e a concentração a ser utilizada. De modo geral, a impressão das membranas utilizando-se o equipamento Q-Bot (Genetix) foi bastante uniforme entre as repetições, apresentando muito baixa variação e como esperado, os sinais radioativos apresentados pelos produtos de PCR, foram superiores aos de plasmídeo, devido à razão molar diferente e provável melhor desnaturação devido ao fato de serem fragmentos de DNA lineares.Item Identificação e caracterização molecular de genes envolvidos no metabolismo de diterpenos específicos do cafeeiro(2007) Ferreira, Lucia Pires; Plener, Laure; Marraccini, Pierre Roger Rene; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Pot, David; Embrapa - CaféApesar de pouco estudado, os lipídeos do café desempenham papel importante na qualidade da bebida e do aroma. Cerca de dez a vinte por cento da fração lipídica do café corresponde a diterpenos que além da provável relação com a qualidade também estão relacionados com a questão do café e a saúde. As espécies de Coffea são as únicas capazes de sintetizar os diterpenos cafestol, caveol e seus compostos derivados (16-O-metilcafestol, 16-O-metilcaveol). Visando um entendimento maior dos genes envolvidos na formação dos diterpenos de café, foi realizado um estudo in silico da expressão de três genes que codificam para as primeiras etapas da sua via de biossíntese - copalil difosfato sintase (CPS), caureno sintase (KS) e caureno oxidase (KO). Posteriormente foi feita uma análise da expressão destes genes durante o desenvolvimento de frutos de Coffea arabica cv. IAPAR 59 e Coffea canephora cv. Apoatã. Este estudo permitiu a identificação de um gene para a CPS e KS e dois para a KO. A análise in silico revelou níveis e perfis de expressão específicos para cada gene. Os resultados obtidos in vivo apresentaram algumas diferenças dos dados obtidos in silico, e a comparação de C. arabica e C. canephora também revelou perfis de expressão diferentes para os genes estudados. Esses dados serão confirmados por RT-PCR e um estudo geral do transcriptoma, usando macroarranjos desenvolvidos a partir do Projeto Genoma Café, será iniciado para identificar os outros genes envolvidos nessa via metabólica.Item Análise da expressão de genes candidatos para a tolerância à seca em folhas de clones de Coffea canephora var. Conillon, caracterizados fisiologiamente(2007) Marraccini, Pierre Roger Rene; Silva, Vânia Aparecida; Elbelt, Sonia; Guimarães, Breno Lourenzzo Salgado; Loureiro, Marcelo Ehlers; DaMatta, Fábio Murilo; Ferrão, Maria Amélia Gava; Fonseca, Aymbiré Francisco Almeida da; Silva, Felipe R. da; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - CaféGenes candidatos envolvidos na tolerância à seca no cafeeiro, foram selecionados através de uma analise in silico (Northern eletrônico) das bibliotecas de cDNA SH2 e SH3 presentes na Base de Dados do Genoma Café. Assim, 18 "contigs" apresentando, uma expressão diferencial nas análises in silico, foram identificados e caracterizados por análises de Northern-blot, utilizando-se RNA total extraído de folhas de clones de Coffea canephora var. Conillon, sensíveis e tolerantes à seca, caracterizados fisiologicamente em experimentos com vasos realizados em casa de vegetação. Os resultados de caracterização fisiológica indicam que o clone 22 (sensível) apresentou queda mais rápida do potencial hídrico, devido à maior condutância estomática. Além disso, sob -3,0MPa, o clone 22 apresenta menor fotossíntese que os demais, devido ao maior estresse oxidativo que ocorre nas folhas. Os resultados das análises da expressão gênica indicam que a maioria dos genes candidatos identificados pelas análises de Northern eletrônico, também apresentavam expressão diferencial nas análises por Northern-blot. Além disso, alguns desses genes candidatos, apresentavam perfil de expressão diferencial entre os quatro materiais genéticos testados (clones sensíveis vs. tolerantes à seca). Perspectivas de uso dessas informações são discutidas. Palavras-chave: tolerância seca, estresseItem Análise in silico e in vivo da via de isoprenóides em café(2007) Tiski, Iris; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Pot, David; Marraccini, Pierre Roger Rene; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Embrapa - CaféOs diterpenos cafestol e caveol, presentes na fração lipídica em grãos de café, originam-se da via de síntese de isoprenóides. Estes compostos são sintetizados em todos os organismos, sendo abundantes em plantas com cerca de 10 mil componentes relatados. Apesar da diversidade de funções e estruturas todos os isoprenóides derivam de cinco comuns átomos de carbono, o isopentenil difosfato (IPP) e do isômero dimetilalil difosfato (DMAPP). Em vegetais superiores, duas vias localizadas em compartimentos intracelulares separados estão envolvidas na biossíntese de IPP e DMAPP. No citosol, IPP é derivado da via do ácido mevalônico (MVA) e no plastídeo, IPP é formado pela via do metileritritol fosfato (MEP ou não mevalonato). Com a disponibilidade das seqüências dos genes expressos (ESTs) pelo Projeto Genoma Café tornou-se possível a identificação in silico e o estudo funcional dos genes que codificam para as enzimas 3-hidroxi-3metilglutaril-CoA reductoisomerase (HMGR) e mevalonato difosfato decarboxilase (MPDC) para a via MVA e 1-deoxi-D-xilulose 5-fosfato reductoisomerase (DXR) e isopentenil difosfato sintase (IDS) para a via MEP. Foram obtidas 13 ESTs de HMGR, que originaram três contigs incompletos, resultando em duas isoformas. Para o gene MPDC foram encontradas 7 ESTs que clusterizaram em somente uma isoforma, diferentemente de A. thaliana onde duas isoformas são encontradas. Para os genes da via MEP foram encontrados 22 ESTs para DXR e 47 ESTs para IDS que formaram apenas um contig para cada um destes genes. Southern blots dos genes HMGR e DXR também demonstraram a presença de duas isoformas para HMGR e uma para DXR em C. arabica. Análise da expressão por Northern blots detectou transcritos do gene DXR no começo de desenvolvimento do perisperma e nas fases finais de desenvolvimento de endosperma e polpa. Transcritos da isoforma HMGR2 foram detectados em polpa, perisperma e endosperma, em todas as fases de desenvolvimento do fruto. Entretanto, HMGR1 apresentou transcritos apenas em polpa e fase inicial do desenvolvimento de perisperma e endosperma.Item Polimorfismos nucleotidicos de genes envolvidos nas características químicas do grão de café. Complementaridade das estratégias in silico e in vivo(2007) Lannes, Sérgio Dias; Bouchet, Sophie; Ferreira, Lucia Pires; Leroy, Thierry; Ivamoto, Suzana Tiemi; Marraccini, Pierre Roger Rene; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Pot, David; Embrapa - CaféA compreensão das bases genéticas da composição química do grão de café é indispensável para a gestão dos programas de melhoramento que têm como objetivo a qualidade da bebida. O desenvolvimento da genômica permite hoje a identificação de genes candidatos que são potencialmente envolvidos nessas características. Entretanto, a utilização destas novas ferramentas para o melhoramento depende da capacidade de identificar dentro de todos esses candidatos,, os que controlam a variabilidade das características entre genótipos. Essa identificação envolve o teste das relações entre os polimorfismos dos genes e a variabilidade fenotípica. A avaliação da diversidade nucleotídica pode ser feita de duas maneiras: usando as informações disponíveis nos bancos de dados EST (estratégia in silico) ou por seqüênciamento direto de genótipos de interesse (estratégia in vivo). O objetivo desse estudo foi avaliar o potencial da estratégia de analise de polimorfismos in silico para o café baseado nos bancos de dados disponíveis. Foram estudadas as vias da biossíntese da sacarose e dos diterpenos, compostos com efeitos na qualidade da bebida e na saúde humana, respectivamente. Essa busca permitiu a identificação de 1.1 polimorfismos para cada 100 bp para os 14 genes estudados. Uma avaliação da diversidade nucleotídica in vivo para alguns desses genes (via da biossíntese da sacarose) permitiu comparar essas duas estratégias. A estratégia in silico é complementar à estratégia in vivo permitindo uma avaliação geral dos níveis de polimorfismos dos genes numa larga escala em todo o genoma com um baixo custo.Item Metabolismo de açúcares durante o desenvolvimento de frutos de café(2005) Geromel, Clara; Ferreira, Lucia Pires; Cavalari, Aline A.; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Leroy, Thierry; Mazzafera, Paulo; Marraccini, Pierre Roger Rene; Embrapa - CaféNeste trabalho foi estudada, a sacarose sintase (Susy: EC 2.4.1.13) ao nível bioquímico e molecular durante o desenvolvimento de frutos de café. Os resultados sugerem que Susy é a principal enzima responsável pelo metabolismo da sacarose em frutos de café. Na polpa e no endosperma de frutos nos estádios finais de maturação, um pico de atividade de Susy foi observado e está correlacionado com um aumento de sacarose. Ao nível molecular, foram clonados cDNAs que codificam para duas isoformas diferentes de Susy. Também foi mostrado que ambos genes são expressos de forma diferente ao longo da maturação dos frutos. Ainda, experimentos de marcação com 14C- sacarose e incubação de frutos com 14CO2 foram realizados. Estes experimentos mostraram que os açúcares não são transportados somente das folhas para os frutos, mas também há uma intensa comunicação entre os tecidos que compõem os frutos.Item Caracterização molecular de enzimas chave do metabolismo de açúcares em café(2003) Ferreira, Lúcia P.; Geromel, Clara; Cavalari, Aline A.; Marraccini, Pierre Roger Rene; Mazzafera, Paulo; Pereira, Luiz Felipe Protasio; Vieira, Luis Gonzaga E.; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféNas sementes de café, os carboidratos representam metade da massa seca e participam de extensivas alterações químicas que ocorrem durante a torração da semente. Dentre estes, a sacarose é considerada um dos principais precursores do sabor e do aroma devido a sua rápida degradação, que leva à glicose e à frutose. A quebra da sacarose durante a torração leva à formação de anidro-açúcares (tais como 1,6 anidro-glicose, arabinose e glioxal). Estes, por sua vez, reagem de várias maneiras levando à formação de vários de compostos (ácidos alifáticos, pirazina, compostos carbonílicos, hidroximetil furfural e outros furanos). Apesar disso, muito pouco é conhecido sobre o metabolismo de açúcares em café, particularmente durante a longa fase do desenvolvimento da semente. Desta forma, o objetivo do presente trabalho é compreender melhor o metabolismo de açúcares na semente de café, principalmente o que se refere às relações fonte-dreno durante o seu desenvolvimento e como isto afetará o tamanho da semente. Para atingir estes objetivos, estão sendo utilizadas seqüências de cDNA de invertase (EC 3.2.1.26), sacarose fosfato sintase (EC 2.4.1.14) e sacarose sintase (EC 2.4.1.13) clonadas em nossos laboratórios, ou seqüências provenientes do Projeto Genoma Café (http:// arara.lbi.ic.unicamp.br/cafe/). Os dados sobre o uso dessas seqüências para investigar a expressão durante o desenvolvimento da semente serão apresentados, assim como aqueles relativos a experimentos em que ramos contendo frutos receberam 14 CO2, além da distribuição da radioatividade determinada nos diferentes tecidos dos frutos. As atividades de invertase e sacarose sintase também estão sendo estudadas em folhas de diferentes idades assim como nos diferentes tecidos do fruto.