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Item Análise proteômica de embriões zigóticos e endosperma em sementes de Coffea arabica(2007) Koshino, Lívia L.; Andrade, Aretusa E.; Silva, Luciano P. da; Bloch, Carlos; Franco, Octávio L.; Eira, Mírian T. S.; Teixeira, Joao Batista; Mehta, Angela; Embrapa - CaféDurante o desenvolvimento da semente de café, proteínas vão sendo depositadas, predominantemente nos cotilédones e no endosperma. As proteínas de reserva 11S são as globulinas mais abundantes na semente de café agindo como fonte de nitrogênio nas reações de torra e garantindo o sabor e aroma característicos. Este estudo teve como objetivo analisar o perfil de proteínas expressas em endosperma e embrião zigótico de sementes de café. Proteínas foram extraídas da semente inteira, e também do endosperma e embrião de café, isoladamente. Em seguida, as proteínas foram analisadas por eletroforese bidimensional (2-DE) e posteriormente por espectrometria de massa. Os spots mais abundantes observados no gel de proteínas de semente inteira foram excisados, tripsinizados e identificados como subunidades da proteína 11S através de espectrometria de massa. Spots com o mesmo pI e massa molecular foram também observados no perfil de proteínas do endosperma e embrião, indicando que a proteína 11S é também muito expressa nesses tecidos. Foi possível identificar algumas destas proteínas, que mostraram identidade com a proteína de reserva 11S de café. Foi obtida uma cobertura de seqüência de peptídeos de aproximadamente 20% de toda a proteína 11S. Duas proteínas diferenciais presentes no endosperma foram também analisadas por espectrometria de massa e identificadas através de seqüenciamento de novo como uma glubulina da mesma família da 11S (Cupin superfamily) e uma proteína alergênica (Pru ar 1).Item Produção de calos embriogênicos em genótipos elite de café arábica(2007) Santos, Ana Carolina R.; Oliveira, Paola Lidiene de; Teixeira, Joao Batista; Padilha, Lilian; Carvalho, Carlos Henrique Siqueira de; Embrapa - CaféA propagação vegetativa do cafeeiro via embriogênese somática permite a multiplicação de híbridos e de genótipos segregantes e, aplicada ao melhoramento genético, possibilita reduzir de 30 para cerca de 10 anos, o tempo necessário para o lançamento de novas cultivares. Todavia, esta metodologia de propagação ainda necessita ser otimizada para que seja possível a multiplicação de café arábica em larga escala. Este trabalho objetivou avaliar o potencial de produção de calos embriogênicos friáveis a partir de explantes foliares de 10 plantas matrizes de café arábica com resistência à ferrugem e ao bicho-mineiro e de estudar o efeito da adição de prolina (0, 200, 400, 800 e 1600 mg.L-1) na indução de calos embriogênicos. Foi também testado o efeito de 9,84 µM de BAP ou de 2iP na indução de calos embriogênicos. A percentagem de calos embriogênicos friáveis formados nos explantes foliares variou de 0 a 64,4%, sendo função da época de plaqueamento e da planta matriz utilizada. Verificou-se também que a adição de prolina ao meio de indução diminuiu a formação de calos, e que a utilização de 2ip foi mais eficiente que a de BAP para formação de calos embriogênicos friáveis.Item Inibidores de [alfa]-amilase e sua aplicação no controle da broca-do-café(2007) Barbosa, Aulus Estevão Anjos de Deus; Barros, Érika V. S. A.; Teixeira, Joao Batista; Sá, Maria Fátima Grossi de; Embrapa - CaféO Brasil é o maior produtor mundial de café, detendo 36% do mercado, e as espécies Coffea arabica (65%) e Coffea canephora (35%) são as mais comercializadas. As plantações de café são atacadas por uma série de pragas agrícolas, sendo a principal delas a broca-do-café (Hypothenemus hampei). Este coleóptero é bastante difícil de ser controlado, pois passa todo o ciclo de vida protegido dentro do fruto do café. O controle é restrito a utilização de inseticida carcinogênico e tóxico para o meio ambiente. Recentemente, foi demonstrando em experimentos in vitro que o inibidor [alfa]-AI1 do feijão Phaseolus vulgaris inibe a atividade das duas [alfa]-amilases presentes no trato intestinal da broca-do-café. Em nosso grupo de trabalho foi demonstrado que um inibidor de [alfa]-amilase presente em acessos do feijão selvagem Phaseolus coccineus ([alfa]IPC) é altamente ativo contra [alfa]-amilases desta praga. A disponibilidade em nosso laboratório destes gene e de técnicas eficientes para transformar geneticamente C. arabica e C. canephora tornaram possível a obtenção de plantas de café transformadas com o gene do inibidor [alfa]-AI1 e de embriões selecionados com o inibidor [alfa]IPC para o controle da broca. Utilizando a técnica de biobalística em calos embriogênicos de C. arabica foram obtidas 6 plantas positivas para o gene [alfa]-AI1, já identificadas via Southern Blot. Estas plantas apresentaram baixo número de cópias, 5 delas com 1 cópia e apenas uma planta com duas cópias do gene. Duas das plantas positivas por Southern Blot estão produzindo frutos e logo será possível avaliar o nível de expressão do inibidor [alfa]-AI1e a atividade dos frutos transgênicos no controle da broca-do-café via bioensaios. Os calos embriogênicos de C. arabica e C. canephora transformados com o inibidor de alfa-amilase do feijão Phaseolus coccineus estão em meio de indução de regenerando embriões dos calos selecionados. O resultado deste trabalho poderá resultar em cultivares de café menos impactantes ao meio ambiente, tornando o café brasileiro mais competitivo no mercado internacional.Item Obtenção de mudas clonais de café (Coffea arabica L.) via embriogênese somática(2005) Teixeira, Joao Batista; Pereira, Ana J. P.; Junqueira, Cristina Salgado; Mello, Raquel I.S. de; Silva, Ana Paula D. da; Mundim, Danielle A.; Embrapa - CaféA exploração da heterozigose, por meio de cruzamentos inter-varietais e inter-específicos, depende da disponibilidade de uma metodologia de multiplicação vegetativa. Esta metodologia é essencial, tanto para avaliação e seleção de clones em condições de campo quanto para plantios comerciais em larga escala das variedades híbridas após o seu lançamento. Visando revisar a metodologia de clonagem de café via embriogênese somática, experimentos foram conduzidos, nos quais foram utilizadas plantas matrizes de vários genótipos, cultivadas em casa de vegetação. Após a desinfestação, explantes de 0,5 x 0,5 cm aproximadamente foram inoculados em placas de Petri contendo 20 ml do meio básico de MS a 50%, acrescido de 4,9 mM de IBA, 9,8 mM de 2-iP e 20 mM de 2,4-D. Após 30 dias, os explantes foram transferidos para placas contendo o mesmo meio fresco, com redução do 2,4D para 10 mM, onde permaneceram por mais 90 a 120 dias até o aparecimento dos setores embriogênicos, quando foi feita a avaliação final. A taxa de formação de calos primários foi próxima de 100% para a maioria dos genótipos, enquanto que a taxa de formação de setores embriogênicos foi de 8,3; 36,8; 41,9; 100 e 84,3%, respectivamente para 'Mundo Novo', 'Icatu Amarelo', 'Acaiá Cerrado', 'Catuaí Vermelho' e 'Rubi'. Os setores embriogênicos foram isolados e diferenciados em meio de regeneração de MS a 50%, acrescido de 1,3 mM de ANA e 8,8 mM de BAP. A taxa de regeneração foi de 71,5%. Os embriões foram transferidos para maturação e germinação em meio de MS a 50%, acrescido de 1,1 mM de BAP e 2,6 mM de AIA. Após dois meses, os embriões foram transferidos para meio de crescimento em magenta, constituído do meio básico de DKW a 20%, acrescido de 1,3 mM de BAP. Com mais um a dois meses de cultivo, as plântulas foram transferidas para casa de vegetação para aclimatação.Item Regeneração de embriões a partir de calo embriogênico friável do tipo HFSE de duas espécies de café (Coffea canephora, Coffea arabica)(2001) Junqueira, Cristina Salgado; Souza, Carolina Werneck de; Teixeira, Joao Batista; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféForam realizados experimentos com a finalidade de propor um protocolo eficiente para a regeneração de embriões somáticos de café, originados a partir de calos embriogênicos friáveis. Foi avaliada para ambas as espécies a influência de diferentes níveis de maltose (2, 4 e 6%) e 4% de sacarose e diferentes combinações de BAP/ANA, mg/L: 2,0/0,0; 2,0/0,25; 2,0/0,5; 2,0/1,0; 1,0/0,0; 2,0/0,0; e 4,0/0,0. Para a espécie de Coffea canephora, só houve regeneração no meio com diferentes níveis de açúcar, na presença de 4,0 mg/L de BAP. No entanto, para a espécie Coffea arabica, pode-se observar que o subcultivo nos tratamentos com diferentes combinações de BAP e ANA foi essencial para uma melhor resposta na regeneração. Quanto à influência dos açúcares, a melhor resposta foi obtida na presença de 4% de sacarose e 2% de maltose, principalmente para as fases globular e coração. A sincronização não foi marcante em nenhuma das espécies, embora tenha sido observada em alguns tratamentos maior freqüência de embriões na fase globular.Item Influência dos níveis de 2-iP e 2,4-D na embriogênese somática de folhas de plantas de Coffea canephora e Coffea arabica(2001) Teixeira, Joao Batista; Arimura, Célia Tacaco; Junqueira, Cristina Salgado; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféA exploração da heterozigose em café depende da disponibilidade de uma eficiente metodologia de multiplicação vegetativa, a qual se encontra em fase de teste em escala piloto tanto para Coffea arabica quanto para Coffea canephora. Dos fatores do meio de cultura que influenciam a taxa de indução de embriogênese somática em café, isopenteniladenina (2-iP) e ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) têm um papel determinante no processo. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo avaliar as concentrações relativas de 2i-P e 2,4-D na indução de formação de calos embriogênicos do tipo HFSE ("High frequency somatic embryos") e LFSE ("Low frequency somatic embryos"), em uma cultivar de C. arabica (Catuaí Vermelho) e um genótipo de C. canephora (E1571/99). A formação de calo embriogênico do tipo LFSE foi estimulada pelo aumento de 2-iP, enquanto o do tipo HFSE foi estimulado pelo aumento de 2,4-D em ambas as espécies. Em C. canephora, a formação de LFSE e HFSE chegou a 100% na presença de 2,5, 5,0 ou 10.0 mM de 2-iP e 5,0 mM 2,4-D, respectivamente. Em C. arabica, a percentagem de formação tanto de LFSE quanto de HFSE foi menor, chegando a 63,6 de LFSE em 15 mM de 2-iP e 90,6% de HFSE em 20 mM de 2,4-D. O subcultivo aos 30 dias foi benéfico em explantes de C. arabica, o contrário do observado para explantes de C. canephora. Em geral, este subcultivo contribuiu para a formação e o crescimento de calo friável não-embriogênico, o que prejudicou a formação de LFSE em C. canephora.Item Biorreator de imersão temporária desevolvido pela Embrapa - Recursos Genéticos e Biotecnologia(2001) Teixeira, Joao Batista; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféA participação da mão-de-obra na produção de mudas via micropropagação pode chegar a 70% do custo final. Visando economia de mão-de-obra, a Embrapa-Recursos Genéticos e Biotecnologia deu início há alguns anos ao desenvolvimento de um biorreator de imersão temporária. Este sistema de cultivo foi escolhido tendo em vista que a maioria dos biorreatores publicados eram do tipo de imersão contínua e foram delineados para cultivo de células vegetais e de microrganismos, não constituindo a melhor alternativa para o cultivo de gemas e embriões somáticos. A construção do primeiro protótipo da Embrapa teve como referência o biorreator de imersão temporária desenvolvido pelo CIRAD, que é conhecido como sistema RITA. O sistema desenvolvido pela Embrapa é composto de pares de frascos ao contrário do sistema RITA, o qual consiste de dois compartimentos em um só frasco. No compartimento inferior o meio de cultura fica armazenado e, no superior, é mantido o explante. No sistema desenvolvido pela Embrapa, em um frasco é estocado o meio de cultura enquanto que no outro é feito o cultivo do explante, que podem ser células, gemas ou embriões somáticos. Os pares de frascos são conectados via canalização a um sistema de válvulas solenóides, as quais controlam a direção do fluxo de ar procedente do compressor, de acordo com a programação dos temporizadores eletrônicos, aos quais são conectadas as válvulas. Após testes preliminares, verificou-se um perfeito funcionamento do sistema, o qual está sendo avaliado para cultivo de calo e embrião somático de café.Item Expressão do gene Gus em embriões zigóticos e calos embriogênicos de Coffea arabica e C. canephora(2001) Barros, Érika V. S. A.; Cunha, Welcimar G. da; Teixeira, Joao Batista; Brasileiro, Ana Cristina M.; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféA metodologia de biolística foi utilizada para a transformação genética de Coffea spp. Foram bombardeados embriões zigóticos de C. arabica e calos embriogênicos de C. arabica e de C. canephora. Embriões da cultivar IAPAR 59 foram testados nos dias 2, 5, 7, 9 e 12 do período de cultivo anterior ao bombardeamento. A expressão transiente foi observada em 30 embriões de cada idade após 48 horas do bombardeamento, através de teste histoquímico com X-glu. Outros 30 embriões foram mantidos em meio seletivo com imazapyr 300 nM por 15 d. O maior número de pontos azuis nas análises transiente e estável da expressão do gene gus foi observado na idade de 12 d. Com base neste resultado, foram testados 700 embriões da cultivar Mundo Novo nas mesmas condições, sendo a expressão estável analisada em brotos emergentes após 60 d. Verificou-se que partes de alguns brotos apresentaram coloração azul, indicando a formação de mosaicos. O material de calos embriogênicos proveniente de folhas de cafeeiro foi bombardeado em meio C contendo 0; 0,25; e 0,5 M de manitol. Observou-se o maior número de pontos azuis na análise transiente de amostras dos calos submetidos a pré-tratamento osmótico, sugerindo que esta etapa possa otimizar a transformação deste material.