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Item Genomic identification, gene expression and enzyme activity of CAZymes from biotrophic fungus Hemileia vastatrix during coffee leaf infection(Universidade Federal de Minas Gerais, 2021-02-25) Pereira, Júlia Santos; Mendes, Tiago Antônio de OliveiraCoffee leaf rust, caused by the fungus Hemileia vastatrix, is a major disease that affects many coffee producers around the world, causing a huge economic loss. H. vastatrix is a biotrophic fungus, hence, its growth and reproduction are totally dependent on the cells of the living host. Because of that, they infect the tissue without causing necrosis. Nevertheless, it is known that some fungi during plant interaction can express genes involved in the formation of infectious structures, as well as synthesize enzymes responsible for the degradation of the host cell wall. However, little is known about the importance of cell wall degrading enzymes (CWDE) for biotrophic phytopathogens. In this work, we performed genomic analysis to identify CAZymes (Carbohydrate Active EnZymes) from H. vastatrix and the analysis of expression and enzyme activity during experimental coffee infection. The first step was the ab initio prediction of H. vastatrix genome, using AUGUSTUS program, which was adjusted with H. vastatrix RNA-Seq for model determination. Functional annotation to identify CAZymes was performed using dbCAN2 meta server. Among the 345 CAZymes found, 162 belong to Glycoside Hydrolases (GH) including 34 endoglucanases, xylanases and polygalacturonases from families GH 5, 9, 10, 12 and 28 - which may act during fungal infection degrading the highest prevalent components of cell wall, represented by cellulose, xylan and pectin, respectively. Physico-chemical parameters of these enzymes were checked, including identification of catalytic residues and standard CAZymes motifs. The enzyme structures were also modelled. Moreover, analysis of expression of enzymes were performed using RNA-seq data from a genotype of C. arabica susceptible to infection, therefore presenting compatible interaction with the pathogen, after 0, 12, 24 and 96 hours after inoculation (hai). Enzyme activity assays were carried out in order to verify if these enzymes were also active during the fungal infection. The enzymes showed typical physico-chemical characteristics and structures of active enzymes including conservation of the catalytic sites. Genes encoding endoglucanases and xylanases were expressed during different times of H. vastatrix infection, being the first more expressed at 12 hai and the other at 24 hai. In agreement with expression data, endoglucanases started to be produced early, and were more active at 24 hai, whereas xylanases had greater activity at 96 hai. The results suggest that biotrophic fungus also use active enzymes on carbohydrates during the infection. In relation to H. vastatrix, these enzymes start being produced at the pre-haustorial phase of the fungal infection, but are more active at the post-haustorial phase, when the haustorium begins to be formed in the host membranes and in the plant cell wall.Item Análise de fatores aplicada em estudos de seleção genômica no melhoramento de Coffea canephora(Universidade Federal de Viçosa, 2020-02-20) Paixão, Pedro Thiago Medeiros; Nascimento, Ana Carolina Campana; Nascimento, Moysés; Azevedo, Camila FerreiraO Brasil se destaca em âmbito mundial na produção de café. Os incrementos observados em sua produtividade é resultado do aprimoramento de diversas metodologias. Dentre elas, destacam-se os métodos preditivos de valor genético. Estes contribuem significativamente na seleção de genótipos superiores, de forma a aumentar o ganho genético por unidade de tempo. Neste contexto, a seleção genômica ampla (GWS) é uma ferramenta que se destaca, uma vez que permite predizer o fenótipo futuro de um indivíduo baseado apenas em informações de marcadores moleculares. Realizar a seleção de maneira simultânea para várias características é o interesse da maioria dos programas de melhoramento, e a análise de fatores (AF) tem sido utilizada para auxiliar neste fim. A utilização de fatores se justifica devido a existência de correlações genéticas entre as características, as quais podem ser atribuídas aos QTL que têm efeitos pleiotrópicos ou aos QTL estreitamente ligados. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi de avaliar o uso da AF no contexto de GWS, em genótipos de Coffea canephora. Os resultados obtidos da seleção baseada nos fatores foram comparados, por meio da capacidade preditiva, acurácia e do coeficiente de Cohen’s Kappa, com aqueles advindos da análise das variáveis individuais. Para isso, foram utilizados dados fenotípicos e genotípicos de populações compostas por clones dos grupos varietais Conilon e Robusta e por híbridos originados de cruzamentos entre estes grupos, avaliados durante três anos consecutivos (2014 a 2016), e uma densidade de 18111 marcadores SNPs identificados. A partir dos resultados observados, verificou-se que a AF foi eficiente para elucidar as relações entre as características e originar novas variáveis. Os fatores formados são interessantes em termos de seleção, pois além de permitirem interpretações conjuntas, apresentam boas estimativas de capacidade preditiva, herdabilidade e acurácia. Ademais observou-se alta concordância entre os indivíduos selecionados com base nos fatores e aqueles selecionados considerando as variáveis individuais. Entretanto, cabe destacar que, a seleção baseada nos fatores conseguiu selecionar indivíduos de porte mais adequado. Palavras-chave: Predição Genômica. Análise Multivariada. Melhoramento Genético.Item Diversidade genética, ganhos com seleção e seleção genômica ampla na espécie Coffea canephora(Universidade Federal de Viçosa, 2017-07-31) Alkimim, Emilly Ruas; Caixeta, Eveline Teixeira; Silva, Felipe Lopes da; Resende, Marcos Deon Vilela deA presença de variabilidade genética associada a estratégias mais eficientes de seleção são imprescindíveis para se obter sucesso nos programas de melhoramento. Nesse sentido, o uso de marcadores moleculares em estudos de diversidade, bem como a seleção baseada em dados fenotípicos por meio do uso de procedimentos genético-estatísticos mais refinados têm se mostrado ferramentas úteis nos programas de melhoramento. Além disso, com o avanço das plataformas de NGS (Next Generation Sequencing), um novo método de seleção, que visa utilizar dados fenótipos e moleculares, denominado Seleção Genômica Ampla foi proposto. O objetivo do trabalho foi identificar marcadores SNP (Single Nucleotide Polymorphism) e validá-los em estudos de diversidade genética; estimar os parâmetros genéticos e os ganhos com a seleção utilizando a metodologia de modelos mistos (REML/BLUP); aplicar o princípio da GWS (Genome Wide Selection) e avaliar sua eficiência em população de C. canephora. A população em estudo, inicialmente, foi composta por 72 genótipos nos quais os marcadores SNP foram identificados e validados. A seleção fenotípica, por meio do procedimento REML/BLUP, foi realizada em 192 genótipos de cafeeiros. Por fim, a população avaliada por meio da GWS foi composta por 165 genótipos. Utilizando a plataforma de sequenciamento da empresa RAPiD Genomics foram identificados 117.450 SNP em 72 indivíduos de C. canephora. Após análises de qualidade, 33.485 SNP foram selecionados e validados em análises de diversidade e estrutura genética de populações. Os marcadores foram eficientes na avaliação da diversidade e estrutura genética de C. canephora e com base em nessas análises foi possível selecionar possíveis cruzamentos promissores dentro e entre os grupos varietais e Híbridos geneticamente mais distantes. Com base nas análises utilizando o método REML/BLUP foi possível selecionar genótipos Conilon e Robusta promissores por serem geneticamente divergentes pela análise de agrupamento e por proporcionarem ganhos elevados com a seleção. Estes podem ser intercruzados para obter cultivares dentro de cada grupo varietal e/ou como genitores em cruzamentos interpopulacionais. Além disso, foi possível selecionar famílias híbridas que se destacaram nas análises. Estas podem ser testadas em diferentes regiões e as promissoras utilizadas como variedade propagada por semente. As famílias híbridas selecionadas podem também ser intercruzadas (cruzamento intrapopulacional) para avanço da seleção recorrente. Por fim, a GWS mostrou-se ferramenta útil para o melhoramento de C. canephora, por predizer com alta acurácia os valores genéticos genômicos dos indivíduos e possibilitar a redução no tempo necessário para completar o ciclo de seleção, proporcionando ganhos significativos em eficiência seletiva por unidade de tempo.Item Painéis de marcadores de baixa densidade para a predição genômica de Coffea arábica L.(Universidade Federal de Viçosa, 2021-07-22) Arcanjo, Edilaine Silva; Nascimento, Ana Carolina Campana; Azevedo, Camila Ferreira; Nascimento, MoysésOs processos de melhoramento genético são primordiais para o desenvolvimento de novas cultivares. Em decorrência da importância da cafeicultura brasileira, esse setor tem sofrido transformações através das pesquisas em programas de melhoramento. Os progressos do Coffea arábica atingidos pelo melhoramento genético têm propiciado a aquisição e recomendação de inúmeras cultivares que possuem características que a elas foram adicionadas por essa técnica. Entretanto, um dos maiores impasses do melhoramento genético vegetal é que para a obtenção de uma nova cultivar, o processo é muitas vezes lento e demorado. Dessa forma, o uso da biotecnologia, com a utilização dos marcadores moleculares, apresentou-se como uma alternativa para amenizar esse problema. Neste contexto, foi proposto a seleção genômica ampla (Genome Wide Selection-GWS), que parte do pressuposto que todos os segmentos do genoma colaboram para a variação genética e cada segmento está em alto desequilíbrio de ligação (LD) com no mínimo um marcador genético conhecido. A GWS fundamenta-se nos marcadores moleculares do tipo SNP (Single Nucleotide Polymorphism), que são abundantemente distribuídos ao longo do DNA. Com o advento dos SNPs, os valores genéticos genômicos estimados (GEBVs) puderam ser calculados através dos efeitos desses marcadores. Desse modo, os SNPs têm proporcionado a melhor cobertura do genoma; no entanto, normalmente a execução da seleção genômica requer uma grande genotipagem populacional para os indivíduos de treinamento e os candidatos à seleção, o que pode ocasionar em um aumento do custo total do programa de melhoramento. Assim, este trabalho teve por objetivo avaliar a viabilidade do uso de painéis de marcadores de baixa densidade na predição do GEBV de características economicamente importantes de C. arábica, com a finalidade de reduzir os custos de genotipagem a partir da utilização de chips customizados. Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que o uso desses painéis na GWS pode ser uma ferramenta útil para o melhoramento dessa espécie, uma vez que modelos baseados nestes painéis apresentaram boas estimativas de capacidades preditivas e substanciais valores de concordância em termos de seleção quando comparados à modelos de maior densidade de marcadores. Palavras-chave: Melhoramento Genético. Café. Seleção Genômica. G-BLUP.Item Modelagem do metabolismo do café durante a infecção por Hemileia vastatrix em plantas susceptíveis e resistentes(Universidade Federal de Viçosa, 2018-07-13) Gazolla, Lizandra Cristina de Oliveira Figueiredo; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Caixeta, Eveline TeixeiraO Brasil é o país com a maior produção e exportação de café e as espécies mais cultivadas mundialmente são o Coffea arabica e o Coffea canephora. A doença do cafeeiro de maior relevância no cenário mundial é a ferrugem alaranjada, causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix. O principal sintoma é o aparecimento de manchas amareladas na parte abaxial das folhas e, em condições climáticas favoráveis, as perdas na lavoura podem chegar a 50% da produção. O cultivar Híbrido de Timor CIFC 832/2 tem sido uma importante fonte de genes de resistência para os programas de melhoramento. Entretanto, o alto potencial adaptativo do fungo e a própria pressão seletiva causada pela utilização de cultivares resistentes vem culminando no surgimento de diversas raças fisiológicas do fungo capazes de suplantar a resistência obtida através dos métodos clássicos de melhoramento. Uma nova abordagem no estudo da relação parasito-hospedeiro é a integração de dados de genômica e outras ômicas para a construção de um modelo metabólico. Através da análise de balanço do fluxo (FBA) é possível simular o papel de cada gene na célula auxiliando na compreensão da interação entre o cafeeiro e o fungo. Com isto, o presente trabalho propôs a construção de um modelo metabólico baseado no genoma seguido da análise de FBA para cultivares resistente e susceptível após a infecção por H. vastatrix. Os dados de transcriptomica foram integrados ao modelo original gerando modelos contexto- específicos. Essas análises indicaram um acúmulo de glicerol-3-fosfato (G3P) no Hibrido de Timor CIFC 832/2 sugerindo que o metabolismo primário contribui para a resistência do cafeeiro, uma vez que a participação deste metabólito na resposta imune adquirida de plantas já foi demonstrada.Item Identificação de genes que codificam potenciais proteínas efetoras envolvidas no patossistema Hemileia vastatrix - cafeeiro(Universidade Federal de Viçosa, 2016-02-16) Castro, Isabel Samila Lima; Caixeta, Eveline TeixeiraA ferrugem do cafeeiro é causada pelo fungo Hemileia vastatrix. Trata-se de um parasita biotrófico que infecta apenas o cafeeiro sendo responsável por grandes perdas na produção. Apesar da eficiência dos fungicidas, o emprego de cultivares resistentes é o melhor método de controle, sendo econômico, eficiente, além de não causar impactos ambientais. O grande desafio para os melhoristas é o surgimento de novas raças do patógeno capazes de suplantar a resistência das cultivares resistentes desenvolvidas. A raça XXXIII de H. vastatrix foi recentemente identificada no Brasil, infectando algumas cultivares resistentes à ferrugem do cafeeiro. Durante a interação com a planta hospedeira, os fungos causadores de ferrugem secretam um arsenal de proteínas efetoras que modificam a estrutura e a função da célula hospedeira, permitindo o estabelecimento (ou não) da colonização do parasita. Dessa forma, objetivou-se com esse trabalho, caracterizar genes que codificam proteínas secretadas pelo fungo, por meio de análises de bioinformática e de expressão temporal de genes, que podem funcionar como proteínas efetoras de H. vastatrix (raça XXXIII), a fim de auxiliar a compreensão do processo infeccioso do patógeno. Dentre os 615 genes candidatos a efetores, obtidos a partir de um genoma de referência do fungo, a grande maioria, 376 e 88, apresentaram similaridade com as proteínas de Puccinia sp e Melampsora larici-populina, respectivamente. Utilizando o software BLAST2GO, foi realizada a categorização funcional desses genes. A partir dos resultados do BLASTp, foram extraídos 310 termos GO, distribuídos em três categorias. A categoria mais representada foi “Função Molecular” com 137 termos, seguida por “Processos Biológicos”, 126 termos, e “Componente Celular”, 47 termos. De acordo com a anotação de Enzyme Codes (EC) obtida, as classes enzimáticas mais representadas foram as hidrolases, transferases e as oxidurredutases. Foram selecionados 13 genes para a análise de expressão temporal. A analise foi efetuada pela técnica de PCR em tempo real (RT-PCR), nos tempos 12, 24, 48 e 72 horas após a inoculação (hai) de urediniósporos frescos em plantas de cafeeiro resistente (CIFC 832-1) e suscetível (Caturra) à ferrugem. Foi possível obter quatro padrões diferentes de expressão. Tais padrões sugerem que os genes analisados possam estar envolvidos na tentativa de sobrevivência do fungo em resposta a resistência da planta, na fase biotrófica da infecção, além de genes relacionados com a supressão da resposta de defesa da planta durante a penetração, no reconhecimento do hospedeiro e/ou na fase inicial da colonização. Os resultados indicaram que pode ocorrer comunicação entre o fungo e o hospedeiro, logo no início da infecção, ainda na fase de germinação dos esporos. Estudos biológicos funcionais deverão ser realizados para determinar a verdadeira função desses efetores durante a interação de H. vastatrix com o cafeeiro. Essas informações são úteis para os estudos que visam o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na suplantação da resistência por novas raças do fungo, fornecendo subsídios para o desenvolvimento de cultivares com resistência durável.Item Marcadores microssatélites em estudo de diversidade, mapeamento genético e análises de QTLs em Coffea canephora(Universidade Federal de Viçosa, 2013-02-05) Ferrão, Luís Felipe Ventorim; Caixeta, Eveline TeixeiraO uso de marcadores moleculares em estudos genético apresenta-se como uma técnica potencialmente capaz de auxiliar no melhoramento genético de Coffea canephora. Neste contexto, os marcadores microssatélites (SSR) tem sido preferencialmente escolhidos, pois agregam qualidades importantes, dentre as quais se destacam a reprodutibilidade, altos níveis de polimorfismos, expressão codominante e multialelismos. Em programas de melhoramento genético essa tecnologia pode ser utilizada para diferentes finalidades com destaque para os estudos de diversidade genética, que auxiliam na avaliação dos recursos genéticos disponíveis e seleção de potenciais genitores; e nas análises de QTLs, que permitem a elucidação do caráter quantitativo e utilização dessas informações em programas de seleção assistida por marcadores (SAM) e clonagem posicional de genes. Neste sentido o presente trabalho teve como objetivo geral demonstrar a aplicação dos marcadores microssatélites em estudos de diversidade, mapeamento genético e análises de QTLs em C. canephora. Nos estudos de diversidade genética, apresentados no capítulo 1, o resultado da codificação de dados nas avaliações de germoplasma foi mensurado e observou-se uma perda significativa de informações genéticas, o que influencia no manejo e caracterização dos recursos genéticos armazenados nas coleções. Para os estudos de mapeamento e análises de QTLs, apresentados no capítulo 2, os marcadores SSR foram utilizados para a construção do mapa de ligação genético e identificação de fatores genéticos associados à resistência à ferrugem (Hemileia vaxtatrix), que atualmente é a principal doença foliar do cafeeiro. Neste estudo, progênies de irmãos completos de uma população de melhoramento do Incaper (Instituto Capixaba de Pesquisa, Assistência Técnica e Extensão Rural) foram genotipadas e fenotipadas, considerando componentes de resistência avaliados em campo e em laboratório. O resultado do mapeamento de QTL foi a identificação, no grupo de ligação 1, de QTLs significativos para todas as características consideradas no estudo, o que tornou essa região genômica potencialmente útil em estudos de clonagem posicional ou SAM, em programas de melhoramento genético. Por fim, visto a importância dos marcadores moleculares nos estudos com cafeeiros, no capítulo 3, foi descrito um conjunto de 101 novos primers SSRs, minerados de sequencias expressas (EST) do Projeto Brasileiro do Genoma Café. O nível de polimorfismos, a taxa de transferabilidade e sua aplicação em estudos de caracterização molecular e mapeamento genético dentro do gênero Coffea foram considerados e mostrou que os EST-SSR descritos são ferramentas de grande valia para estudos genéticos com cafeeiros. Dessa forma, os resultados obtidos nesse estudo são importantes para os estudos genéticos dentro da espécie, uma vez que foram disponibilizados conhecimentos importantes que tangem o manejo de germoplasmas, seleção de genótipos resistentes à ferrugem, diversidade genética e seleção assistida por marcadores moleculares.