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Item Resistência múltipla de Coffea canephora conilon a Meloidogyne spp.: mecanismos e genes candidatos(Universidade de Brasília, 2015-03-26) Lima, Edriana Araújo de; Furlanetto, CleberO cafeeiro é uma das culturas mais importantes para o Brasil, sendo fonte de divisas para os países tropicais produtores. Das mais de 90 espécies do gênero Coffea, C. arabica e C. canephora são as espécies cultivadas comercialmente. Os grãos de C. arabica são mais consumidos e apreciados no mundo, mas C. canephora possui uma parte importante do mercado no que se refere à produção de café solúvel e blends com C. arabica, além de ser fonte de resistência a patógenos como os nematoides das galhas. Espécies do gênero Meloidogyne constituem um dos mais importantes fitopatógenos por sua polifagia, causando danos e perdas consideráveis em culturas importantes, como o cafeeiro. Cultivares de C. canephora têm sido usadas como porta enxertos para C. arabica e, programas de melhoramento vem produzindo plantas que podem ser promissoras no controle desse patógeno. No entanto, até o presente momento, esses genótipos foram resistentes a uma ou duas espécies de Meloidogyne. Os objetivos desse trabalho foram: buscar fontes de resistência às populações de Meloidogyne em clones de C. canephora desenvolvidos pelo Instituto Capixaba de Pesquisa e Extensão Rural (INCAPER); observar os possíveis mecanismos de resistência envolvidos e também quais genes poderiam ser candidatos à resistência. No primeiro instante, clones de C. canephora população Conilon foram avaliados quanto à resistência a seis populações de Meloidogyne. Nesse primeiro ensaio, descobriu-se que o clone 14, já previamente avaliado como tolerante a seca, foi resistente a todas as populações testadas do patógeno. Por meio de histopatologia, observou-se no clone 14 inoculado com M. paranaensis e M. incognita, através da histopatologia, morte celular e reação de hipersensibilidade tanto no período inicial de infecção do patógeno, quanto nos dias finais da observação, nas células ao redor dos poucos nematoides que conseguiram iniciar o sítio de alimentação. Não houve desenvolvimento do nematoide nem produção de ovos observados através da microscopia e a penetração dos juvenis também foi sensivelmente menor no clone 14 resistente quando comparado aos cafeeiros suscetíveis. Não houve diferença na reação de resistência da planta entre as duas espécies/populações de nematoides das galhas usadas no estudo da histopatologia. Raízes do clone 14 e do padrão de suscetibilidade clone 22, foram inoculadas com M. paranaensis e retiradas nos mesmos moldes do ensaio de histopatologia, para a extração de RNA e produção de cDNA para serem utilizados no sequenciamento e qPCR, respectivamente. Foi observada diferença na expressão de genes de resistência, genes relacionados à produção de lignina, cisteína protease e inibidor de cisteína protease e no hits, dentre outros, entre os clones resistente e suscetível. No caso da cisteína protease e lignina- forming, a expressão foi 3.000 e 6.000 vezes maior no clone resistente que no clone suscetível a M. paranaensis nos dias finais do ciclo do nematoide, coincidindo com o período de intensa morte celular e reação de hipersensibilidade na raiz do clone 14. Os resultados demonstraram que o clone 14 pode ser importante fonte de genes relacionados com a resistência à Meloidogyne spp. e que esses genes devem ser estudados mais profundamente no futuro a fim de obter maior conhecimento sobre os mecanismos moleculares envolvidos no processo de resistência aos nematoides das galhas e os possíveis pontos de intersecção entre os estresses bióticos e abióticos.Item Expressão de genes envolvidos na biosíntese de manitol em Coffea arabica submetido a estresses abióticos e contribuição de homeólogos de Coffea canephora(Universidade Federal do Paraná, 2013) Carvalho, Kenia de; Bespalhok Filho, João CarlosO Brasil se destaca como principal produtor e exportador mundial de café. Em 2013, o país deverá colher mais de 50 milhões de sacas de café beneficiado. Embora a produtividade e o consumo aumentem a cada ano, os cafeeiros ainda são sujeitos a oscilações de produção, o que pode ser explicado pelo ciclo bienal da planta e também por condições ambientais, como estresses abióticos. Dentre estes destacam-se seca, salinidade e altas temperaturas. Quando submetidas a estresses, as plantas podem sintetizar osmoprotetores, como o álcool açúcar manitol, um composto ainda pouco estudado em espécies perenes, como o café. Além disso, enquanto alotetraploide, as respostas transcricionais de Coffea arabica são um conjunto da expressão de dois subgenomas. Assim, o presente trabalho teve como objetivo investigar a influência da seca, salinidade e alta temperatura no perfil transcricional dos genes envolvidos na síntese e catabolismo de manitol, bem como a concentração de carboidratos sob esses estresses; além da contribuição do homeólogo de C. canephora na regulação transcricional destes genes. Para estudar a transcrição gênica, normalizadores foram previamente avaliados, onde, verificou- se que em condições de alta salinidade os normalizadores mais adequados são EF1, EF1α e UBQ10, e em condições de alta temperatura são os genes MDH, GAPDH e EF1α. Para o déficit hídrico, utilizou-se dois normalizadores da literatura, GAPDH e UBQ10. Esta avaliação possibilitou a inclusão de dois novos genes para normalização de dados, MDH e EF1. Este estudo também demonstrou que a síntese de manitol é alterada em condições de estresses abióticos; que há modulação transcricional dos genes CaM6PR, CaPMI e CaMTD, principalmente sob condição de seca; e que o subgenoma Coffea canephora é o principal responsável pelo perfil transcricional destes genes.Item Improvement characteristics of semi-dry coffee fermentation with starter yeasts(Universidade Federal de Lavras, 2017-02-14) Gelvez, Silvia Juliana Martinez; Schwan, Rosane FreitasBrasil é conhecido mundialmente por ser um dos maiores produtores e exportadores de café. Antes de produzir a bebida, os grãos de café devem passar por método de processamento, que pode ser o seco, semi-seco e o úmido. A escolha do tipo de processamento vai depender do produtor ou do agricultor. Durante o processo, os frutos ou grãos são fermentados espontaneamente durante a secagem até atingir a umidade de, aproximadamente, 11%. Algumas vezes, as culturas iniciadoras são utilizadas para ajudar na fermentação, resultando em cafés especiais. Os microrganismos naturais do café envolvem leveduras, fungos filamentosos, bactérias aeróbicas e facultativas que, ao longo da fermentação, consomem açúcares, produzindo ácidos e, consequentemente, baixando o pH. Cafés de alta qualidade têm sabor e aroma característicos e a maioria tem compostos benéficos para a saúde. No presente estudo, o objetivo foi avaliar o comportamento de três leveduras iniciadoras (Saccharomyces cerevisiae CCMA 0543, Candida parapsilosis CCMA 0544 e Torulaspora delbrueckii CCMA 0684) inoculadas em café processado via semisseca, implementando dois métodos de inoculação, inoculação direta e inoculação em balde. A população total de leveduras, bactérias lácticas e mesófilas foi avaliada por plaqueamento. Além disso, a população das culturas iniciadoras foi monitorada por PCR em tempo real (qPCR). Os metabólitos produzidos e consumidos nos grãos verdes e torrados durante a fermentação foram avaliados por cromatografia líquida (HPLC) e cromatografia gasosa (GC-MS). Finalmente, foi feito o teste de xícara para avaliação da bebida final. O resultado de contagem em placa mostrou que o método em balde manteve alta população de leveduras, bactérias lácticas e mesófilas no final da fermentação (secagem). A sacarose foi consumida em todos os tratamentos avaliados. Os ácidos cítrico e succínico foram detectados durante todos os tempos de fermentação. Após torra, a média de ácido clorogênico foi maior no método em balde, e o mesmo foi observado para as concentrações de trigonelina e cafeína, exceto no tratamento com T. delbrueckii CCMA0684. Nos grãos verdes, álcoois e ácidos, e nos grãos torrados, pirazinas e piridinas foram os principais compostos voláteis detectados por GC-MS. As notas do teste de xícara foram acima de 80 para os dois métodos de inoculação, demonstrando que a inoculação teve efeito positivo e produziu bebidas de boa qualidadeItem Análise da expressão do gene manose 6 fosfato redutase em cafeeiros submetidos ao déficit hídrico(Editora UFLA, 2013-01) Freire, Luciana Pereira; Marraccini, Pierre; Rodrigues, Gustavo Costa; Andrade, Alan CarvalhoOs efeitos do déficit hídrico sobre a expressão do gene CaM6PR, codificando a manose-6-fosfato redutase, foram avaliados em cafeeiros em fase de formação das cultivares IAPAR59 (Villa Sarchi x hibrido de Timor HT832/2) e RUBI MG 1192 (Mundo Novo x Catuaí) de Coffea arabica, consideradas respectivamente como tolerante e sensível ao estresse hídrico. As cultivares foram plantadas em dezembro de 2007 no campo experimental da Embrapa Cerrados – DF (CPAC) e cultivadas durante dois anos (2008 e 2009) com (I) e sem (NI) irrigação. Para cada ano, foram realizadas duas avaliações (P1, não estressado, durante a estação chuvosa e P2, estação seca). Para as duas cultivares, a expressão do gene CaM6PR foi medido em folhas por meio da técnica de PCR quantitativa, apresentou um forte aumento na estação seca para as plantas não irrigadas em comparação com as plantas irrigadas. Além disso, a expressão desse gene sempre foi maior no IAPAR59 que no RUBI MG 1192. Também, observou-se uma maior expressão desse gene no ano de 2008, quando comparada ao ano de 2009. Essa diferença poderia ser uma consequência direta dos níveis de estresse hídrico recebidos pelas plantas, já que as condições da seca em 2008 foram mais severas do que no ano de 2009. Assim,nesse trabalho, propõe-se o uso do gene CaM6PR como marcador molecular, para avaliar o nível de estresse das plantas cafeeiras submetidas ao déficit hídrico.Item Analysis of the mannose 6 phosphate reductase gene expression in coffee trees submitted to water deficit(Editora UFLA, 2013-01) Freire, Luciana Pereira; Marraccini, Pierre Roger; Rodrigues, Gustavo Costa; Andrade, Alan CarvalhoThe effects of water deficit on the gene CaM6PR expression, encoding mannose -6- phosphate reductase, were evaluated in coffee trees in the formation phase of coffee cultivars IAPAR59 (Villa Sarchi x Timor hybrid HT832 / 2) and RUBI MG 1192 (Mundo Novo x Catuaí) of Coffea arabica, respectively regarded as tolerant and sensitive to water stress. The cultivars were planted in December 2007 in the experimental field of Embrapa Cerrados - DF (CPAC) and cultured for two years (2008 and 2009) with (I) and without (NI) irrigation. For each year two assessments were carried out (P1 , not stressed, during the rainy season and P2 , dry season). For both cultivars, the CaM6PR gene expression measured in leaves through quantitative PCR, showed a strong increase in the dry season for non-irrigated plants when compared with irrigated plants. In addition, the expression of this gene was always greater in IAPAR59 than in RUBI MG 1192. Also, there was an increased expression of this gene in 2008 when compared to 2009. This difference could be a direct consequence of drought stress levels received by plants, since drought conditions in 2008 were more severe than in 2009. Thus, in this work, we propose the use of the CaM6PR gene as a molecular marker to evaluate the stress level of the coffee plants submitted to water deficit.Item Caracterização in silico e análise da expressão de microRNas e genes alvo em diferentes espécies de Coffea(Universidade Federal de Lavras, 2012-02-24) Silva, Samuel Chaves; Chalfun Júnior, AntonioO fenômeno de RNA de interferência mediado por microRNAs, é uma via importante para a estabilidade e regulação da tradução de RNA mensageiros. Muitas das vias reguladas são fundamentais para o desenvolvimento do organismo e para a manutenção da integridade do genoma. Alta homologia em sequência e estrutura são características interessantes dos genes que codificam estas moléculas. Estas particularidades permitem que, a partir de sequências de RNAs silenciadores conhecidos em outras espécies, microRNAs homólogos sejam descritos em espécies filogeneticamente relacionadas. A partir das informações geradas pelo sequenciamento do café, durante o projeto CAFEST, foi possível, pela primeira vez, identificar microRNAs (miRNAs) envolvidos na modelagem do transcriptoma das espécies Coffea arabica, Coffea canephora, Coffea congensis e Coffea eugenioides. Neste estudo são apresentadas as sequências, estruturas e possíveis funções dos microRNAs no cafeeiro. Além da caracterização estrutural, também foram apresentados resultados de qRT-PCR que correlacionam a expressão dos genes MIR e seus genes alvos. As diversas famílias de miRNAs descritas para o cafeeiro, estão correlacionadas a diferentes processos biológicos que incluem, padrões de crescimento vegetal, processos metabólicos, respostas hormonais, degradação de proteínas, respostas a estresses e rotas de sinalização celular. A grande variedade de genes alvo indica a plasticidade funcional destas moléculas e reforça a importância do entendimento das vias de silenciamento gênico, para futuros trabalhos envolvendo a manipulação e o desenvolvimento da cultura do café.Item Identificação e caracterização de genes candidatos para a tolerância à seca em cafeeiro(Universidade Federal de Lavras, 2009-02-26) Vinecky, Felipe; Andrade, Alan CarvalhoA cultura cafeeira é importante economicamente e amplamente explorada no Brasil. A área plantada está bem difundida em todo território, onde são produzidos C. arabica e C. canephora, dependendo da região plantada. De modo geral, seca e temperaturas desfavoráveis são as principais limitações climáticas à produção do cafeeiro. A importância de tais limitações deve aumentar, em função das mudanças reconhecidas no clima global e, também, porque a cafeicultura vem sendo expandida para regiões marginais onde secas e temperaturas desfavoráveis se constituem em grandes limitações à produção do café. Por isso a pesquisa científica com foco em minimizar os danos causados pelos estresses abióticos é de fundamental importância para a cafeicultura. O objetivo deste trabalho foi identificar genes candidatos para a tolerância à seca, utilizando diferentes estratégias. Inicialmente foi avaliada a expressão diferencial de genes de bibliotecas de folhas de café cultivado em condições de estresse hídrico, por meio de análises in silico dos dados do Genoma Café. Em seguida, foram realizados experimentos com hibridização de macroarranjos de cDNA de café a partir de RNA obtido de folhas de duas cultivares de café, uma tolerante ao estresse hídrico (Clone 14) e outra sensível (Clone 22), ambas submetidas a irrigação normal (controle) e a restrição no fornecimento de água. Por último, a expressão diferencial de 29 genes pré-selecionados nos experimentos de macroarranjo foi analisada, utillizando-se a técnica de PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Para as reações de qPCR as amostras utilizadas foram o Clone 22 irrigado e não irrigado e outros três clones tolerantes (Clone 14, 73 e 120 irrigados e não irrigados). Os resultados obtidos com as análises de qPCR, mostraram que a maioria dos genes testados apresentaram expressão diferencial entre os tratamentos controle e não irrigado, confirmando os dados obtidos nos experimentos de macroarranjos..Todas as técnicas utilizadas neste trabalho, foram eficientes em identificar genes candidatos para a tolerância à seca em cafeeiro, sendo que alguns genes apresentaram resultado positivo de expressão diferencial em todas as três metodologias utilizadas. Os vários genes candidatos responsivos à seca em cafeeiro, identificados neste trabalho, permitem uma melhor compreênsão das estratégias utilizadas pela planta para suportar o déficit hídrico e esses genes, podem também ser usados, para o melhoramento biotecnológico do cafeeiro. Além disto, marcadores moleculares associados à tolerância à seca em cafeeiro podem ser desenvolvidos com base nos genes candidatos identificados, visando-se um programa de melhoramento genético do cafeeiro, por seleção assistida.Item Expressão de genes relacionados ao metabolismo do nitrogênio em mudas de café arábica submetidas a déficit hídrico(Embrapa Café, 2015) Souza, Bruna Pereira de; Martinez, Hermínia Emilia Prieto; Caixeta, Eveline Teixeira; Carvalho, Felipe Paolinelli de; Clemente, Junia Maria; Florez, Juan Carlos; Lelis, Daniela Teixeira; Zambolim, LaércioO estresse hídrico afeta o metabolismo celular vegetal, incluindo a assimilação do nitrogênio, com consequências drásticas no crescimento e desenvolvimento da planta. Dessa forma, nesse trabalho foi avaliado a influência do déficit hídrico na transcrição diferencial de genes relacionados ao metabolismo do nitrogênio. O experimento foi montado em um esquema fatorial 2 x 2, compostos de 2 cultivares de café (Catuaí Amarelo IAC62 e Mundo Novo IAC379-19) e dois tratamentos (sem déficit hídrico e com déficit hídrico), no delineamento em blocos casualizados com três repetições, onde cada parcela era constituída por duas plantas. Folhas foram coletadas às 8 e 96 h após aplicação dos tratamentos e tiveram o RNA extraído. Avaliou-se o perfil transcricional dos genes NIA2 (Nitrate Reductase [NADH] 2), GLN1.3 (Glutamine Synthetase Cytosolic Isozyme 1.3) e GLT1 (Glutamate Synthase 1 [NADH]). Esses genes foram identificados em outras espécies de plantas como sendo envolvidos na assimilação do nitrogênio. Observou-se que os três genes estudados aumentaram rapidamente a sua expressão em plantas submetidas ao déficit hídrico. A cultivar Catuaí Amarelo apresentou maior indução do gene NIA2, enquanto que a cultivar Mundo Novo apresentou maior transcrição diferencial dos genes GLN1.3 e GLT1. A maior indução dos genes pode indicar medida adaptativa nessas condições de estresse. Esses dados sugerem que em condições de déficit hídrico o ciclo de assimilação do nitrogênio na cultura do café é rapidamente remodulado.