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Item Caracterização fenotípica e molecular da resistência do cafeeiro Híbrido de Timor a Hemileia vastatrix(Universidade Federal de Viçosa, 2010-07-16) Pestana, Kátia Nogueira; Sakiyama, Ney Sussumu; Caixeta, Eveline Teixeira; Zambolim, Eunize MacielCom o intuito de dar suporte aos programas de melhoramento do cafeeiro que visam à obtenção de cultivares resistentes à ferrugem (Hemileia vastatrix), neste trabalho objetivou-se estudar a herança da resistência do Híbrido de Timor UFV 443-03 e identificar marcadores moleculares ligados aos genes caracterizados. Para o estudo de herança foram avaliadas três populações originadas do cruzamento entre o progenitor resistente Híbrido de Timor UFV 443-03 e o cultivar suscetível Catuaí Amarelo (UFV 2148-57). Dessas plantas analisadas, 243 correspondem a uma população F2, 114 a retrocruzamento suscetível (RCs) e 87 a retrocruzamento resistente (RCr). A inoculação foi realizada com a suspensão de esporos (2 mg/mL) do isolado da Raça I de H. vastatrix, em discos foliares, com três repetições para as populações F2 e RCs e duas para RCr. As plantas do Catuaí Amarelo UFV 2148-57 foram suscetíveis em todas as inoculações, enquanto o Híbrido de Timor UFV 443-03, a planta F1 e as plantas do RCr foram resistentes. Pela análise de segregação das populações F2, obtiveram-se duas hipóteses significativas: uma de que a resistência do cafeeiro Híbrido de Timor UFV 443-03 a H. vastatrix era governada por dois genes dominantes e independentes (15:1; P = 63,10) e a outra de que era conferida por três genes, sendo dois dominantes e um recessivo (61:3; P = 8,87). Plantas do RCs foram utilizadas para a confirmação dos padrões de segregação e segregaram na proporção de 3:1 (P = 74,56), o que era esperado para dois e para três genes. Esse resultado indicou que a resistência desse Híbrido de Timor é condicionada por dois genes dominantes independentes ou três genes independentes (dois dominantes e um recessivo). Como a herança encontrada foi oligogênica (dois ou três genes), para a confirmação e identificação de marcadores moleculares ligados aos genes, estes foram tratados como QTL e, então, localizados em mapa genético de ligação. Para isso, os indivíduos da população F2 foram analisados com um total de 110 marcadores moleculares. Como 16 marcadores apresentaram distorção da razão de segregação mendeliana esperada, o mapa foi construído com 94 marcadores (62 AFLP, 28 SSR e 4 RAPD). Considerando um LOD score mínimo de 3 e máxima recombinação de 40%, os marcadores ficaram agrupados em 11 grupos de ligação, cobrindo uma distância de 964,31 cM do genoma, e 13 marcadores não se ligaram a nenhum dos grupos formados. O maior intervalo entre dois marcadores foi de 32,1 cM, e 68,57% dos marcadores não excederam 20 cM. A caracterização e identificação de QTLs foram realizadas com o auxílio de metodologias de marca simples e intervalo simples. Pela metodologia da marca simples foi possível identificar cinco marcadores associados aos QTLs pelos métodos da ANOVA, regressão e máxima verossimilhança. Esses QTLs foram confirmados pela metodologia de intervalo simples por meio da regressão e máxima verossimilhança. Dois QTLs foram identificados, um deles no grupo de ligação 2 a 0 cM do marcador 21a, explicando 9,6% da variação fenotípica. O outro ficou localizado no grupo de ligação 3 a 13 cM do marcador 43a, explicando 9,3% da variação fenotípica. Esses dois QTLs confirmam, em número e posição, que a resistência do cafeeiro Híbrido de Timor UFV 443-03 a H. vastatrix é governada por dois genes dominantes e independentes, mostrando, assim, a importância da genômica para a identificação destes genes. Cabe salientar que as informações deste trabalho são inéditas para o caso do cafeeiro e podem ser úteis em programas de melhoramento baseado em seleção assistida e na clonagem posicional do gene de resistência à ferrugem. Assim, os dados deste estudo deverão fornecer subsídios para futuros trabalhos de melhoramento visando à obtenção de populações mais resistentes e produtivas.Item Visão computacional aplicada a análise de frutos de C. Arabica(Universidade Federal de Lavras, 2023-03-16) Botega, Gustavo Pucci; Gonçalves, Flávia Maria AvelarAt coffee research centers, various traits are phenotyped by researchers. Some of these traits are directly determined by fruit phenotyping, such as ripening. Fruit ripening is an important trait to measure, because it allows for cultivars release with different ripening cycles, which is essential for farmers as it allows for the scaling of production and maximization of efficiency and profitability. However, measuring this trait in breeding programs presents several challenges. This study was divided into three chapters that present a comprehensive evaluation of coffee fruit and aspects associated with the selection and evaluation of ripening in Coffea arabica. In the first chapter, coffee fruits obtained from a phenotyping platform were thoroughly evaluated, by examining their morphological and color characteristics using computer vision. To achieve it, a classification model based on convolutional neural networks was created to classify the different stages of ripening. In the second chapter, images were synthesized from the generated image dataset to train a computer vision model based on the YOLO neural network architecture for direct classification and detection of coffee fruits in numerous scenarios and environments. In chapter 3, the objective was to establish the ideal sample size for ripening fruit evaluation and to verify the associated errors in adopting each sample size, as well as to demonstrate that the K-means clustering method can be an alternative to assist researchers in making decisions about the constituent genotypes of the breeding population. Detailed analysis was conducted on fruits from 21 cultivars, providing valuable information to researchers about their morphological and color characteristics. A total of 36.879 images of coffee fruits at different ripening stages were created. The use of the YOLO architecture allows for the direct evaluation of coffee fruits in different scenarios and environments, reducing and facilitating the process of phenotyping the trait. It was found that samples larger than 500 ml of fruits demonstrate an excellent sample size, and the use of the Kmeans technique to group data into different ripening cycles can be an excellent alternative for researchers, allowing for precise and efficient analysis.Item Análise funcional do gene órfão CcUNK8 de Coffea canephora via transformação genética de Setaria viridis(Universidade Federal de Lavras, 2014-07-30) Duarte, Karoline Estefani; Marraccini, Pierre RogerO cafeeiro é um dos mais valiosos produtos primários no comércio mundial. Em razão dessa importância econômica, o cafeeiro vem sendo alvo de programas de melhoramento genético visando à introdução de novos caracteres para obtenção de plantas com características agronômicas superiores, por exemplo, com uma maior tolerância à seca. Porém, como melhoramento convencional do cafeeiro é demorado, o uso das últimas técnicas de genômica está sendo desenvolvido para acelerar a criação de novas plantas. Assim, o sequenciamento do genoma e, também, o sequenciamento em larga escala de genes expressos (RNAseq) torna-se algo necessário para analisar o determinismo genético da tolerância à seca e identificar genes candidatos (GCs) atuantes neste determinismo. No cafeeiro, mas também em outras plantas como Arabidopsis thaliana, Oryza sativa e microrganismos, pelas análises dos projetos de sequenciamento demostra-se uma alta porcentagem (cerca de 20- 30%) de genes considerados no hits, ou seja, genes para os quais nenhuma similaridade com as sequências depositadas nos bancos de dados é encontrada. Em Coffea canephora e Coffea arabica foram identificados e caracterizados alguns genes no hits. Alguns desses genes possuem um perfil de expressão onde se observa in silico uma distribuição heterogênia quanto a tecidos e tratamentos utilizados, como é o caso do no hit 33656. Infere-se que no hits possam ter se originado de processos de especiação, portanto poderiam estar interligados a vias de resposta únicas de organismos tolerantes ou susceptíveis a uma dada condição. Pelos dados de qPCR mostra-se que o no hit CcUNK8 apresentou maior expressão em folhas estressadas quando comparado a folhas controle de C. canephora sendo um gene canditado à tolerância à seca e foi, então, selecionado para transformação genética utilizando Setaria viridis como planta modelo.O T-DNA contendo o gene CcUNK8 foi inserido em plantas de Setaria viridis via Agrobacterium tumefaciens e a expressão deste gene foi quantificada por meio de qPCR nos eventos primários de transformação. Em alguns eventos foi observado um acúmulo de biomassa maior de parte aérea e radicular que indivíduos não transformados. Foram observadas, ainda, diferenças no acúmulo de biomassa entre o mesmo evento quando submetido ao tratamento irrigado e não-irrigado.Item Caracterização molecular de cafeeiros do germoplasma Bourbon(Universidade Federal de Viçosa, 2015-03-09) Pestana, Rosa Karla Nogueira; Sakiyama, Ney SussumuCom a crescente demanda do mercado mundial de cafés especiais, os produtores brasileiros têm demonstrado interesse em retomar o cultivo do Bourbon, principalmente devido a seu potencial para produzir cafés de qualidade superior de bebida. Dessa forma, os melhoristas têm buscado incorporar acessos de Bourbon nos programas de melhoramento, a fim de obter cultivares para a produção de cafés especiais. Visando dar suporte aos programas de melhoramento da Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais (Epamig), foi instalado em Patrocínio, MG, um Banco Ativo de Germoplasma (BAG) com 1594 acessos, destes, 140 correspondem a Bourbon. Entretanto, a coleção de germoplasma de Bourbon ainda não foi devidamente caracterizada, fato que interfere no seu aproveitamento para fins comerciais e uso no melhoramento. Deste modo, a caracterização molecular desses genótipos é essencial para ampliar o conhecimento dos materiais genéticos disponíveis e, assim, incorporar os mais adequados nos programas de melhoramento genético do cafeeiro. Nesse sentido, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar, por meio de marcadores SSR e AFLP, a coleção de Bourbon da Epamig, como uma ferramenta auxiliar na identificação dos acessos, avaliação da diversidade genética e do perfil molecular (Fingerprinting) dos genótipos. Na identificação dos acessos, apresentado no capítulo 1, os marcadores SSR foram utilizados para discriminar os genótipos de Bourbon juntamente com as técnicas de analise discriminante e redes neurais artificiais. Os locos SSR analisados foram adequados para diferenciar os acessos. Observou-se que as redes neurais artificiais apresentaram maior eficiência na classificação dos acessos de Bourbon do que a análise discriminante e foi possível identificar acessos que apresentaram misturas ou problemas na identificação inicial. Na avaliação da diversidade genética e do perfil molecular (Fingerprinting) dos acessos, apresentados no capítulo 2, os marcadores SSR e AFLP utilizados permitiram separar a maioria dos indivíduos analisados. Esses dados moleculares sugerem que, apesar da reconhecida base genética estreita de C. arabica, o germoplasma de Bourbon pertencente a Epamig apresenta variabilidade genética que pode ser explorada nos programas de melhoramento. A análise de fingerprinting permitiu identificar os perfis moleculares de cada acesso de Bourbon avaliado, os quais podem ser utilizados na identificação dos cafeeiros no banco. Dessa forma, os resultados obtidos nesse estudo fornecem subsídios para a manutenção e conservação da coleção de germoplasma de Bourbon. Além disso, deve auxiliar os melhoristas na escolha de genitores para possíveis hibridações em programas de melhoramento que buscam o desenvolvimento de cultivares com potencial para qualidade de bebida.Item Análise citológica e perfil de expressão gênica de Hemileia vastatrix (raça XXXIII) na interação com o cafeeiro(Universidade Federal de Viçosa, 2015-08-12) Lopes, Rejane do Livramento Freitas; Sakiyama, Ney SussumuA raça XXXIII de Hemileia vastatrix foi recentemente identificada no Brasil, infectando algumas cultivares resistentes à ferrugem do cafeeiro. Embora o processo infeccioso de H. vastatrix seja bem estudado, não existem informações acerca da interação de cafeeiros com esta raça do fungo. Diante disso, um dos objetivos deste trabalho foi avaliar o processo de colonização do fungo e as respostas de defesa da planta em genótipos de cafeeiro resistente (Híbrido de Timor – HDT CIFC 832/1) e suscetível (C. arabica cv. Caturra CIFC 19/1) infectados pela raça XXXIII. As primeiras respostas citológicas induzidas pelo fungo foram observadas particularmente nas células estomáticas de ambos os genótipos, às 17 horas após inoculação (hai), e corresponderam à morte celular e ao acúmulo de compostos fenólicos. No genótipo suscetível, o fungo foi capaz de colonizar os tecidos do hospedeiro e produziu um grande número de haustórios, culminando na esporulação cerca de 20 dias após a inoculação (dai). Ao contrário, no genótipo resistente, o crescimento do fungo foi impedido, com alta frequência no estádio pré-haustorial. Estas observações citológicas indicam que a resistência de HDT CIFC 832/1 à raça XXXIII de H. vastatrix é pré-haustorial, ao contrário da resistência pós-haustorial que é geralmente descrita para interações cafeeiro - H. vastatrix. Com base nesta análise, foram definidos os tempos mais adequados para o estudo de genes expressos ao longo do processo infeccioso. Embora o sequenciamento do transcriptoma tenha sido bastante utilizado em estudos de interação planta-patógeno, uma das maiores dificuldades consiste na separação dos transcritos provenientes da planta e do fungo, principalmente quando não existe genoma de referência. Por esta razão, foi realizado o sequenciamento e a montagem do transcriptoma de esporos hidratados e germinados da raça XXXIII de H. vastatrix. A montagem resultou em 32.882 contigs, a partir dos quais foi gerado um conjunto de 11.989 genes preditos. Plantas de C. arabica cv. Caturra Vermelho (CIFC 19/1) e Híbrido de Timor (CIFC 832/1) foram inoculadas com esporos frescos de H. vastatrix (raça XXXIII) para estabelecer uma interação compatível e incompatível, respectivamente. Como controle, foram utilizadas folhas não inoculadas. Nos tempos de coleta pré-definidos (12, 24, 96 horas e 17 dias após a inoculação), as folhas foram removidas e utilizadas para extração de RNA. O sequenciamento das dez bibliotecas de cDNA foi realizado na plataforma Illumina MiSeq, gerando um total de 206 milhões de reads. Após tratamento dos reads, foi realizado o mapeamento das bibliotecas da interação, utilizando como referência o transcriptoma de H. vastatrix previamente montado. Os dados obtidos mostraram que muitos genes de H. vastatrix são similares aos genes do cafeeiro, o que dificulta o estudo da expressão de genes na interação. Por outro lado, genes não conservados entre os dois organismos puderam ser avaliados quanto à sua expressão. Foi verificada a presença de muitos genes comuns às duas interações (compatível e incompatível), sendo que a grande maioria não apresentou expressão diferencial, principalmente nas fases iniciais do processo infeccioso. As maiores diferenças entre as interações foram encontradas aos 17 dai, consistindo principalmente de genes “no hit”, ou seja, genes que não apresentam similaridade com sequências dos bancos de dados de proteínas. Estas sequências podem corresponder a genes específicos de H. vastatrix. As informações geradas nesta pesquisa poderão auxiliar no melhor entendimento da interação entre H. vastatrix e o cafeeiro. O conhecimento dos genes expressos durante a infecção poderá auxiliar no entendimento dos mecanismos moleculares que levam à suplantação da resistência por novas raças do fungo.Item Crescimento vegetativo e anatomia caulinar de cafeeiros enxertados(Universidade Federal de Lavras, 2006-02-20) Dias, Fábio Pereira; Mendes, Antônio Nazareno GuimarãesVisando obter informações sobre o desenvolvimento e as características anatômicas do caule de cafeeiros (Coffea arabica L.) enxertados em porta- enxerto Apoatã IAC 2258 (Coffea canephora), foram instalados e conduzidos esses ensaios, de outubro de 2003 a maio de 2005. O delineamento experimental utilizado foi o de blocos casualizados, com quatro repetições, montado em esquema de parcelas subdivididas no tempo. Foram utilizadas: sete cultivares de C. arabica, três tipos de mudas (enxertada, auto-enxertada e pé franco), duas testemunhas do porta-enxerto Apoatã, pé franco e auto-enxertada, avaliadas em quatro épocas. Foram analisados altura de planta, diâmetro de caule, área foliar, massa seca da parte aérea, massa seca do sistema radicular, número de ramos plagiotrópicos e número de nós nos ramos plagiotrópicos. Os resultados obtidos permitiram verificar que a muda enxertada não é superior à muda de pé franco para todas as características avaliadas, independentemente da cultivar. O porta- enxerto Apoatã IAC 2258 não apresenta mais massa seca de raiz que as plantas enxertadas e pé franco de C. arabica na fase de muda, mas, quando avaliadas aos 16 meses após o plantio, este foi superior às plantas de C. arabica, enxertadas ou não. As características anatômicas não evidenciam sinais de incompatibilidade anatômica entre as cultivares analisadas e o porta-enxerto Apoatã IAC 2258.Item Estudo da expressão e análise de polimorfismos de genes candidatos para a tolerância à seca em cafeeiro(Universidade Federal de Lavras, 2010-08-31) Freire, Luciana Pereira; Marraccini, Pierre Roger RenéO cafeeiro é uma planta perene, pertencente à família Rubiaceae e ao gênero Coffea. Entre as espécies cultivadas, Coffea canephora (Robusta) e Coffea arabica (Arabica) são as mais importantes economicamente, representando respectivamente 30% e 70% da produção comercial mundial. O déficit hídrico afeta a cultura do cafeeiro podendo resultar em importantes conseqüências sociais (deslocamento de trabalhadores), econômicas e ecológicas. Estudos na área de melhoramento do café têm visado à introdução de novos caracteres para a obtenção de híbridos mais tolerantes à seca. Em nível molecular, existem projetos para se identificar genes candidatos (GC) para a tolerância à seca, seja por meio de estudos da expressão gênica (transcriptoma) ou de proteínas (proteômica). Assim, o primeiro objetivo desse trabalho consistiu em estudar a expressão de GCs (DREB, NAC-R26, RD29, GC10, CCoAMT, OEC, CA, M6FR, as isoformas RBCS1-A e B do gene RBCS), utilizando-se vários cultivares de C. arabica cultivados em campo sob situações diversas de estresse hídrico, por meio da técnica de PCR em tempo real (qPCR). Os GCs utilizados foram previamente identificados e validados, em experimentos com cultivares de C. canephora cultivados em casa de vegetação. O segundo objetivo consistiu em analisar a diversidade nucleotídica in vivo de alguns GCs (DREB, RD29 e NAC-RD26), identificando-se SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), em várias espécies, clones e cultivares de café para tentar relacionar a ocorrência de SNPs com o fenótipo. Para a busca de SNPs , DNA genômico (gDNA) dessas diferentes plantas foram amplificados com dois primers específicos para cada GC utilizado. Os primeiros primers contêm nas extremidades adaptadores M13For ou M13Rev, os quais permitiram avaliar a presença de SNPs, por meio do seqüenciamento dos produtos de PCR sem a clonagem. Para se identificar as formas alélicas presentes em cada genoma, primers (sem adaptadores) foram usados para se amplificar, clonar e seqüenciar as mesmas porções de gDNA. Para o sequenciamento, foram utilizados 10 clones independentes, visando-se a identificação do máximo possível de alelos. As seqüências resultantes foram alinhadas, pelo emprego de aplicativos computacionais visando-se a identificação de regiões polimórficas.