Teses e Dissertações
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Item Análise funcional da região promotora de haplótipos do gene CcDREB1D de Coffea canephora via transformação genética de Nicotiana tacabum cv. SRI(Universidade Federal de Lavras, 2014-02-28) Aquino, Sinara Oliveira de; Marraccini, Pierre RogerEstudos recentes resultaram na identificação de vários genes candidatos para tolerância à seca que apresentaram expressão diferencial contrastante entre genótipos. Dentre esses, encontram-se genes integrantes da via de resposta ao estresse hídrico, tais como os fatores de transcrição DREB. Resultados da expressão do gene CcDREB1D nas folhas dos clones 14 (tolerante) e 22 (sensível) de Coffea canephora Conilon mostraram uma maior expressão desse gene em condição de défice hídrico no clone 14 comparado ao clone 22. Após sequenciamento, polimorfismos na região promotora do gene CcDREB1D, que podem indicar a participação de três haplótipos (15, 16 e 17) no controle genético da tolerância à seca, foram identificados nos clones 14 e 22. Visando estudar a participação dos polimorfismos na resposta à seca, várias construções gênicas, com diferentes fragmentos da região promotora do gene CcDREB1D, foram arquitetadas no vetor binário pBI101 e testadas via transformação genética de Nicotiana tabacum cv. SRI, a fim de avaliar a capacidade dos fragmentos de controlarem a expressão do gene repórter β-glucuronidase (uidA). Testes histoquímicos indicaram uma forte atividade GUS (forte coloração) correspondente ao controle positivo (pBI121) enquanto que nenhuma atividade GUS foi detectada para o controle negativo (pBI101). Tanto nas folhas, como nas raízes, uma expressão basal do gene uidA foi verificada nas plantas T0 sem estresse, sobretudo para as construções contendo as versões mais longas (D) do pDREB1D. Para verificar se a região promotora dos haplótipos do gene CcDREB1D responderiam aos estresses abióticos, as plantas transformadas de tabaco foram submetidas a ensaios de desidratação e de temperatura elevada e a expressão do gene repórter uidA foi analisada por testes histoquímicos GUS e PCR quantitativa em tempo real (qPCR). Experimentos de qPCR confirmaram uma leve indução do gene uidA nas folhas das plantas T0 transformadas com pD22-hp17D. No entanto, os níveis de expressão deste gene foram muito inferiores aos das plantas transformadas com o controle positivo (pBI121). Nenhuma indução do gene repórter foi observada nas plantas transformadas com as diferentes construções contendo os outros haplótipos (15 e 16) do promotor CcDREB1D. Contudo, esses resultados mostraram que (1) os promotores pDREB1D de C. canephora são fracos em tabaco, (2) o promotor do haplótipo 17 oriundo do clone 22 de C. canephora é induzido com estresses abióticos nas folhas de tabaco, mostrando que os mecanismos moleculares implicados na regulação da expressão gênica em resposta à seca são (pelo menos parcialmente) conservados entre cafeeiro e tabaco, e que (3) o funcionamento dos promotores pDREB1D dos clones 14 e 22 de cafeeiro é diferencial em tabaco, sugerindo que os polimorfismos identificados nesses promotores participam da regulação destas sequências.Item Estratégias para obtenção e avaliação de plantas de Coffea arabica tolerante ao alumínio(Universidade Federal de Lavras, 2013-07-29) Carvalho, Mayara Holanda de; Paiva, EdilsonO café é um dos mais importantes produtos agrícolas comercializado no mundo, sendo o segundo item em importância do comércio internacional de commodities. Notoriamente, o Brasil é o maior produtor, segundo maior consumidor e um dos principais exportadores dessa cultura. O grande acúmulo de alumínio (Al), em solos ácidos, é um dos maiores entraves na produção agrícola no Brasil. Predominantemente, este metal é encontrado em sua forma iônica (Al 3+ ), que é altamente tóxico às plantas e está presente em grande parte dos solos aráveis em todo mundo. Diante desse fator limitante, pesquisas resultaram na descoberta de vários genes que conferem tolerância ao Al, dentre os quais, destaca-se o SbMATE. Isolado a partir do sorgo, este gene é diferencialmente expresso em altas concentrações de Al 3+ e tem sua atividade elevada no ápice radicular de genótipos tolerantes, conferindo maior resistência ao Al por liberação de citrato na rizosfera. Neste contexto, este trabalho foi realizado com os objetivos centrais de obter plantas quiméricas de Coffea arábica tolerantes ao Al, possibilitando a análise do comportamento dessas plantas em solução nutritiva acrescida de concentrações tóxicas de Al. A inserção de SbMATE aconteceu, por meio de transformação genética com duas cepas (MSU e A4) de Agrobacterium rhizogenes. O material vegetal utilizado foram sementes da cultivar Catiguá germinadas em meio GER com 30 dias de idade e explantes da cultivar Bourbon Amarelo, obtidos por calos embriogênicos. As plântulas da cultivar Catiguá, transformadas com a cepa MSU, tiveram 32% de eficiência de transformação, enquanto que essa taxa baixou para 16% nos explantes transformados com a cepa A4. A cultivar Bourbon obteve uma eficiência de transformação de 75%. Os ensaios, para detectar a concentração de alumínio a ser utilizada nos futuros experimentos de averiguação da tolerância das plantas transformadas, foram realizados em casa de vegetação. Foi utilizada solução nutritiva Hoagland modificada com 1⁄4 de força. O alumínio foi fornecido na forma AlK(SO 4 ) 2 .12H 2 O nas concentrações de 0 mmol. L -1 , 0,833 mmol.L -1 , 1,666 mmol.L -1 e 2,499 mmol. L -1 . O pH das soluções foi mantido em 4,0 ± 0,2, mediante ajustes diários com HCl 0,1 mol. L -1 durante o período de 30 dias. Entre as concentrações de AlK(SO 4 ) 2 .12H 2 O analisadas, a de 0,888 mmol.L -1 foi a mais eficiente, sendo possível visualizar sintomas nítidos da toxicidade do alumínio sem a perda total da planta. O período de 30 dias foi o tempo ideal para a verificação dos principais sintomas da toxicidade ao alumínio nessa concentração. Esse resultado possibilita análises para a visualização de tolerância de plantas geneticamente modificadas de Coffea arabica.Item Biotechnological approaches to improve drought tolerance of Coffea arabica(Universidade Federal de Lavras, 2009-08-28) Stein, Vanessa Cristina; Paiva, RenatoOverexpression of SHINE gene induces the expression of these stress- related genes under normal growth conditions in transgenic plants and then confers the improved tolerance to drought. In recent years rapid procedures for obtaining transgenic roots have been developed using Agrobacterium rhizogenes, leading to the production of so-called “composite plants” comprising a transgenic hairy root system attached to non-transformed shoots and leaves. In the chapter II was determined the effect of (over)expression of the Arabidopsis SHN2 gene in stable and/or chimeric transgenic Arabidopsis thaliana and Brassica rapa plants subjected to drought treatment. In the chapter III was developed an efficient method for coffee genetic transformation by A. rhizogenes in order to create chimeric C. arabica (Catuaí Vermelho IAC 144) with wild-type shoots and transgenic roots for rapid testing of potentially interesting gene construct for future stable transformation using A. tumefaciens or A. rhizogenes and in the chapter IV was expressed the SHN2 gene of Arabidopsis thaliana in transgenic hairy roots of Coffea arabica after Agrobacterium rhizogenes-mediated root transformation in order to improve the drought tolerance of such chimeric plants. 50% of the 35S::SHN2 chimaric transgenic Arabdopsis plants exposed to 10 days withholding water and rewatered for one week recovered the drought treatment. In the coffee transformation 42% of hypocotyls infected A. rhizogenes contained pREDRoot plasmid had at least one transgenic roots and hypocotyls infected with A. rhizogenes contained pMOG22-35S::SHN2 and showed 32% of transformation. In the coffee drought experiment the DsRED (control) chimeric plants did not recover from the 15-day dehydration treatment and completely dried out all while the 35S:SHN2 chimeric plants recovered and become greener and stronger.