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Análise citogenética de Coffea canephora
(2001) Fontes, Bárbara Pereira Dantas; Carvalho, Carlos Roberto de; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
Com o objetivo de obter cromossomos de C. canephora (2n=2x=22) morfologicamente adequados para serem caracterizados citogeneticamente e identificados para montagem do cariograma desta espécie, empregaram-se novas técnicas citogenéticas associadas às metodologias computacionais de análise de imagens. Sementes foram germinadas em placas de Petri a 28oC, em estufa. Raízes com aproximadamente 0,5 cm foram pré-tratadas com brometo de etídeo a 10 µM com 100 µl de DMSO, por 24h a 5oC. Fixaram-se as pontas de raízes excisadas em solução de metanol: ácido acético (3:1), armazenando-as -20oC. Após 24 horas, as pontas de raízes foram digeridas enzimaticamente com solução de Flaxzyme diluída em água destilada (1:60) por 10 minutos à temperatura ambiente. Prepararam-se as lâminas por dissociação celular do meristema, simultâneamente com gotejamento da solução fixadora, sendo elas, em seguida, secadas ao ar. A coloração foi obtida com solução de Giemsa a 2% em tampão fosfato pH 6,8. As metodologias empregadas permitiram a obtenção de cromossomos com alta qualidade citogenética e resolução adequada para caracterização de cada par de homólogos, aparentemente semelhantes, quando obtidos por meio de técnicas convencionais. A caracterização da morfologia desses cromossomos resultou em dados que diferiram daqueles relatados na literatura.
Análise de híbridos interespecíficos em Coffea por citometria de fluxo
(2003) Fontes, Bárbara Pereira Dantas; Carvalho, Carlos Roberto de; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
Métodos de análise do conteúdo de DNA por citometria de fluxo foram originalmente desenvolvidos para estudos em células humanas. Esta metodologia é baseada no uso de fluorocromos DNA-específicos e na análise da intensidade de fluorescência do núcleo corado. Em plantas, a introdução desta metodologia tem sido adaptada para as mais diversas análises, principalmente para avaliação de ploidia, quantificação do tamanho genômico, variações da quantidade de DNA intra e inter-específicas, apoptose, e correlações da quantidade de DNA com variações ambientais. Em estudos de melhoramento genético de plantas, a citometria de fluxo tem sido utilizada principalmente no monitoramento e identificação de híbridos. No presente estudo, amostras das espécies C. racemosa (2x), C. arabica (4x), dos supostos híbridos interespecíficos UFV 557 e das plantas H920, resultantes do retrocruzamento entre C. arabica e UFV 557.3, tiveram seus conteúdos de DNA estimados por citometria de fluxo. Folhas jovens e vigorosas das plantas foram previamente lavadas, acondicionadas em recipiente contendo água destilada e mantidas a 4°C. Após a assepsia, fragmentos de 2 cm 2 foram cortados, com auxílio de uma lâmina de barbear, em 1 mL de solução tampão de lise. A suspensão foi filtrada em uma tela de 30 µm de diâmetro, e transferida para tubos de Eppendorf. Após centrifugação, o sobrenadante foi removido e a camada de núcleos ressuspendida em tampão. A suspensão nuclear foi corada com solução 15 µM de 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), por 10 a 15 minutos, no escuro, e analisada por um citômetro de fluxo equipado com três parâmetros e lâmpada HBO, de arco de mercúrio 100 W, para excitação em UV. Amostragens com coeficientes de variação acima de 3.06% foram desconsideradas. Os valores de DNA estimados para as plantas UFV 557.1; UFV 557.2; UFV 557.3; UFV 557.4; UFV 557.6 foram de 1.95 a 1.97 pg, intermediários aos valores de C. racemosa (2x=1.11 pg) e C. arabica (4x= 2.77 pg), confirmando o caráter triplóide das plantas UFV 557. Os híbridos obtidos entre C. arabica e UFV 557.3 apresentaram valores de 2.75 a 2.79 pg, próximos ao valor do tetraplóide. Os resultados obtidos confirmaram que a citometria de fluxo é uma metodologia importante no monitoramento e identificação de híbridos de Coffea em programas de melhoramento.
Análise morfométrica dos cromossomos de Coffea congensis obtidos de suspensões de agregados celulares
(2005) Clarindo, Wellington Ronildo; Fontes, Marcelo Antoniol; Cruz, Ana Claudia Ferreira da; Carvalho, Carlos Roberto de; Embrapa - Café
O Brasil lidera o mercado mundial de café em produção e exportação e é o segundo maior consumidor desse grão. Parte do aumento da produção tem sido atribuída aos investimentos em programas de melhoramento e às inovações geradas pelos processos biotecnológicos. Espécies do gênero Coffea têm sido objetos de estudos citogenéticos, os quais procuram dados de base citológica e genética para contribuir com programas de melhoramento. Entre os diversos níveis de contribuição, essa linha de pesquisa tem forte potencial como ferramenta de prospecção e monitoramento de genomas, considerando-se que a caracterização dos cariótipos gera informações que se estendem da cultura de tecidos a processos de hibridação. Citogeneticamente procurou-se obter cromossomos com morfologia adequada para caracterização de C. congensis, com aplicação de metodologias que aumentam o índice metafásico e fornecem cromossomos com morfologia mais adequada para caracterização e montagem de cariogramas. O complemento de C. congensis corresponde a 2x=22 cromossomos, sendo quatro metacêntricos (4, 6, 8 e 9) e sete submetacêntricos (1, 2, 3, 5, 7, 10 e 11). A constrição secundária foi identificada na porção distal do braço curto do cromossomo 7. Com este estudo, espera-se que os resultados descritos representem um avanço na prospecção do genoma do cafeeiro.
Avaliação de agregados celulares de café (Coffea spp.) por técnicas citométricas e citogenéticas
(Universidade Federal de Viçosa, 2004) Clarindo, Wellington Ronildo; Carvalho, Carlos Roberto de; Universidade Federal de Viçosa
O Brasil lidera o mercado mundial de café em produção e exportação e é o segundo maior consumidor desse grão. Parte do aumento da produção tem sido atribuída aos investimentos em programas de melhoramento e às inovações geradas pelos processos biotecnológicos. Espécies do gênero Coffea têm sido objetos de estudos citogenéticos e citométricos, os quais procuram dados de base citológica e genética para contribuir com programas de melhoramento. Entre os diversos níveis de contribuição, essa linha de pesquisa tem forte potencial como ferramenta de prospecção e monitoramento de genomas, considerando-se que a caracterização dos cariótipos e a quantificação do conteúdo genômico geram dados que se estendem da cultura de tecidos a processos de hibridação. Levando em conta a necessidade de aprimoramento de estratégias de pesquisas citogenética e citométrica, desenvolveram-se quatro ferramentas de estudo em Coffea. Citogeneticamente, procurou-se obter cromossomos com morfologia adequada para caracterização de C. congensis, com aplicação de metodologias que aumentam o índice metafásico e fornecem cromossomos com morfologia mais adequada para caracterização e montagem de cariogramas. O complemento de C. congensis corresponde a 2x=22 cromossomos, sendo quatro metacêntricos (4, 6, 8 e 9) e sete submetacêntricos (1, 2, 3, 5, 7, 10 e 11). A constrição secundária foi identificada na porção distal do braço curto do cromossomo 7. A citometria de imagem foi utilizada para estimar o conteúdo de DNA em picogramas (pg) de cada cromossomo de C. canephora cv. Apoatã. Neste estudo foi possível mensurar, a partir da densidade óptica, o conteúdo de DNA, com 2C=1,43 pg, dos 11 cromossomos. Os valores encontrados variaram entre 0,18 pg (cromossomo 1) e 0,10 pg (cromossomos 10 e 11). Amostras de calos e agregados celulares de C. canephora cv. Apoatã foram coletadas para verificar se há relação entre os núcleos interfásicos com diferente número e o tempo de manutenção das culturas nas condições in vitro. A partir dos valores percentuais de células com um, dois, três ou quatro nucléolos, foi aplicada a análise de regressão, que indicou que o tempo das culturas in vitro altera o número de nucléolos por núcleo, o que pode ser utilizado como ferramenta no monitoramento de ocorrências de variações somaclonais. Em termos de citometria de fluxo, analisaram-se suspensões nucleares extraídas de agregados celulares fixados de C. arabica cv. Catuaí Vermelho e corados com DAPI. Os histogramas gerados evidenciaram a ocorrência de variação somaclonal (aneuploidias e euploidias) ao longo dos subcultivos das suspensões de agregados celulares com células em diferentes fases do ciclo celular. Com este estudo, espera-se que os resultados descritos representem um avanço na prospecção do genoma do cafeeiro.
Bandeamento NOR e coloração com laranja de acridina em cromossomos metafásicos obtidos de agregados celulares de Coffea canephora
(2003) Clarindo, Wellington Ronildo; Carvalho, Carlos Roberto de; Fontes, Marcelo A.; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
O gênero Coffea pertence à Família Rubiaceae, e apresenta duas espécies de grande importância econômica: Coffea arabica e Coffea canephora. Coffea canephora apresenta 2n=22 cromossomos, sendo um par de cromossomos metacêntricos (número 1), 10 pares de cromossomos submetacêntricos (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11) e um par de cromossomos que possuem, no braço curto, um satélite associado à constrição secundária (6). Este estudo teve como objetivo aplicar técnicas de bandeamentos em cromossomos metafásicos de C. canephora para verificar se constrição secundária, evidenciada no cromossomo número 6, corresponde à região organizadora do nucléolo (NOR). Agregados celulares em suspensão foram obtidos a partir de explantes foliares de C. canephora. Esses agregados foram cultivados em meio estéril de manutenção, em agitador, com ciclos de 110 rpm, à temperatura ambiente. Para obtenção de cromossomos metafásicos, foram adicionados 125 ml de amiprofos-metil (APM) 0,1 mM para cada 50 ml de meio de cultura, resultando numa concentração final de 3,0 mM. Após 4 h de bloqueio, os agregados foram retirados, fixados em solução de metanol:ácido acético (3:1) e armazenados à -20º C. As preparações citogenéticas foram realizadas pela técnica dissociação celular com digestão enzimática Flaxzym â (NOVO), secagem ao ar e coradas com solução de Giemsa 3%, em tampão fosfato pH 6,8, por 3 min. Algumas lâminas foram descoradas com soluções de metanol:ácido acético (3:1) e armazenadas em estufa a 37 0 C, por 7 dias. Após o período de envelhecimento, as lâminas foram tratadas com tampão fosfato, pH=6,5, a 85º C, por 20 min. Em seguida, foram coradas com solução de laranja de acridina a 0,01%, por 15 min, em câmara úmida, e, posteriormente, lavadas e água destilada por 1 min, 2 min e em tampão fosfato por 3 min. Três gotas de tampão fosfato foram adicionadas entre lâmina e lamínula. A técnica clássica de bandeamento NOR foi realizada gotejando-se solução de AgNO3 50% sobre lâminas não coradas. Logo após, as mesmas foram cobertas com lamínulas e colocadas em câmara úmida a 34º C, por 18 h. Decorrido o tempo de armazenamento, as lamínulas foram retiradas com jatos de água e as lâminas, lavadas em água corrente e destilada por 2 min. As preparações foram observadas com objetiva de imersão (100X) e as figuras cromossômicas capturadas com sistema digital de análise de imagem acoplado ao microscópio. O tratamento com APM possibilitou a obtenção de metáfases com cromossomos morfologicamente definidos, alongados e não sobrepostos, permitindo a montagem do cariograma da espécie. Identificou-se a presença de satélite associado à região da constrição secundária, no braço curto do sexto par de homólogos, sugerindo que esta constrição seja a NOR. A marcação positiva, evidenciada pela técnica de bandeamento NOR (Ag-NOR), confirmou que está região é a NOR. A coloração com laranja de acridina revelou uma fluorescência mais intensa nas regiões flanqueadoras da NOR, indicando que estas regiões são heterocromáticas ricas em GC. Com base nos resultados obtidos, pôde-se concluir que a constrição secundária do cromossomo número 6 corresponde à NOR, evidenciada pela técnica Ag-NOR, e que esta região também pode ser identificada pela coloração com laranja de acridina.
Citogenética, citometria de fluxo e citometria de imagem em Coffea spp
(Universidade Federal de Viçosa, 2003) Fontes, Bárbara Pereira Dantas; Carvalho, Carlos Roberto de; Universidade Federal de Viçosa
Com o objetivo de obter cromossomos morfologicamente adequados para serem caracterizados citogeneticamente e identificados para montagem do cariograma de C. canephora (2n=2x=22), C. arabica (2n=4x=44) e C. eugenioides (2n=2x=22), empregaram-se novas técnicas citogenéticas associadas às metodologias computacionais de análise de imagens. As metodologias utilizadas possibilitaram a obtenção do cariograma das três espécies com cromossomos definidos e resolução adequada para caracterização de cada par de homólogos, aparentemente semelhantes quando obtidos por meio de técnicas convencionais. A análise citogenética revelou que C. canephora possui um par de cromossomos metacêntricos (m) e 10 pares submetacêntricos (sm). Foi observada a presença de satélites no braço curto do cromossomo 6, e o comprimento absoluto de seus cromossomos variou de 1,58 a 3,30 µm. A citometria de fluxo foi usada para estimar a quantidade de DNA (valor 2C), na fase G0/G1, em Coffea. Foram analisadas amostras das espécies de C. canephora (2x), C. eugenioides (2x), C. racemosa (2x) e C. arabica (4x); do Híbrido de Timor, híbrido natural triplóide entre C. arabica e C. canephora (4x); dos supostos híbridos interespecíficos naturais entre C. racemosa e C. arabica, denominados UFV 557; e de plantas resultantes do retrocruzamento entre C. arabica e UFV 557. A diferença na quantidade do conteúdo de DNA entre espécies diplóides foi de até 0,50 pg = 45% (Coffea racemosa 1,11 pg; Coffea eugenioides 1,40 pg e Coffea canephora cv. ‘Robusta’ 1,61 pg). Considerando-se os valores intraespecíficos (Coffea canephora 1,43 a 1,61 pg e Coffea arabica 2,40 a 3,04 pg), estas diferenças foram de 0,18 pg (12,59%) e 0,64 pg (26,67%), respectivamente. A citometria de fluxo também revelou-se uma ferramenta importante no monitoramento e identificação de híbridos interespecíficos de Coffea. A citometria de imagem foi empregada para determinação do índice de densidade óptica de preparações de pontas de raízes esmagadas e coradas com reação de Feulgen. O método prófase/telófase (mensuramento de 10 núcleos em prófase e 10 em telófase por lâmina) foi empregado nesta pesquisa. Assim, valores 4C e 2C, referentes ao núcleos em prófase e telófase, foram estimados, e as razões entre os genomas de Coffea arabica cv. Catuaí Vermelho (2n=44) e Coffea canephora cv. Conillon (2n=22) e entre Coffea arabica cv. Mundo Novo e cv. Catuaí Vermelho puderam ser estabelecidas. As estimativas do índice entre as cultivares obtidas pelo método de citometria de imagem foram comparadas com valores obtidos previamente usando a citometria de fluxo e apresentaram diferenças inferiores a 2,27%.
Estudo dos cromossomos de Coffea arabica por métodos de análise de imagem
(2000) Fontes, Bárbara Pereira Dantas; Carvalho, Carlos Roberto de; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
O Coffea arabica, apesar da grande importância econômica, tem sido pouco estudado citogeneticamente. O pequeno tamanho de seus cromossomos tem dificultado análises morfológicas mais detalhadas. No presente estudo, foram utilizadas técnicas citogenéticas com dissociação celular e secagem ao ar para obtenção de cromossomos morfologicamente mais preservados. Metodologias computacionais foram realizadas para obter medições mais precisas, ampliações de imagens cromossômicas, além da montagem do cariograma desta espécie. Sementes de C. arabica foram germinadas em placas de Petri à 28o C, no escuro. Meristemas radiculares foram pré-tratados com solução de Trifluralin a 3mM com 100ml de DMSO, por 18h à 5o C. A fixação foi realizada com solução de metanol ácido acético (3:1) com três trocas. Após 24 horas, as raízes foram digeridas enzimaticamente com Flaxzyme diluída em água destilada (1:10). As lâminas foram preparadas por dissociação do meristema, gotejamento e técnica de secagem ao ar. A coloração foi realizada pela metodologia convencional de Giemsa à 2% em tampão fosfato de pH 6,8. As técnicas permitiram a identificação de cada par de homólogos, possibilitando a obtenção do cariograma do C. arabica, com cromossomos bem definidos, além de proporcionarem a observação de diferenças e similaridades quanto a morfologia.
Padronização de metodologia para mensuramento do conteúdo de DNA de cada cromossomo de Coffea canephora via citometria de imagem
(2007) Clarindo, Wellington Ronildo; Carvalho, Carlos Roberto de; Fontes, Marcelo Antoniol; Embrapa - Café
O Brasil lidera o mercado mundial de café em produção e exportação e é o segundo maior consumidor do grão. Parte desse aumento tem sido atribuída aos investimentos em programas de melhoramento e às inovações geradas pelos processos biotecnológicos. Espécies do gênero Coffea têm sido objetos de estudos citométricos, os quais geram dados de base citológica e genética para contribuir com programas de melhoramento. Entres os vários níveis de contribuição, a citometria de imagem, metodologia que mensura o conteúdo relativo e/ou absoluto de DNA por meio do cálculo da densidade óptica integrada (DOI) de núcleos ou cromossomos corados com reativo de Schiff, fornece informações úteis para o planejamento de projetos de seqüenciamento e estabelecimento de mapas genéticos. O objetivo do presente estudo foi estimar o conteúdo de DNA, em picogramas, para cada cromossomo de C. canephora cv. Apoatã via citometria de imagem. Suspensões de agregados celulares foram tratadas com amiprofos-metil, fixadas e maceradas enzimaticamente. As técnicas de dissociação celular e secagem ao ar foram empregadas no preparo das lâminas, e essas foram hidrolisadas e coradas com reativo de Schiff. As imagens cromossômicas foram capturadas, por meio de microscópio e câmera CCD, e analisadas com recursos digitais de análise de imagem. Os procedimentos metodológicos proporcionaram prometáfases e metáfases contendo cromossomos morfologicamente preservados. Dentre essas imagens mitóticas, foram selecionadas três prometáfases e seis metáfases com cromossomos sem sobreposições e no mesmo plano de foco, estas foram utilizadas na montagem dos cariogramas e no cálculo da DOI. A partir dos valores médios de DOI dos cromossomos e do conteúdo 2C de DNA de C. canephora cv. Apoatã (1,43 pg) foi mensurado o conteúdo de DNA para cada cromossomo, que variou de 0,18 pg (cromossomo 1) a 0,10 pg (cromossomo 11). Os resultados abrangem informações acerca do genoma desta espécie que podem ser úteis em programas de melhoramento, seqüenciamento e em estudos evolutivos.
Utilização de técnicas citogenéticas, de citometria de fluxo e de imagem para caracterização do genoma de Coffea canephora e C. arabica
(Universidade Federal de Viçosa, 2008) Clarindo, Wellington Ronildo; Carvalho, Carlos Roberto de; Universidade Federal de Viçosa
A aplicação de técnicas citogenéticas, de citometria de fluxo e de imagem tem possibilitado a caracterização do genoma de Coffea arabica L. e Coffea canephora Pierre ex Froehner. Esses trabalhos vêm provendo relevantes informações a estudos evolutivos e para o melhoramento da cultura. Levando em conta a necessidade de ampliação das informações acerca do genoma de C. arabica e C. canephora, esse estudo aprimorou estratégias citogenéticas e citométricas para gerar novos dados acerca do genoma dessas espécies. Inicialmente, metodologias citogenéticas aplicadas em suspensões de agregados celulares de C. canephora geraram cromossomos com morfologia adequada para caracterização morfométrica e montagem do cariograma da espécie. A aplicação das técnicas de bandeamento Ag-NOR e Hsc-FA possibilitaram a identificação da NOR ativa no braço curto do cromossomo 6. Após empregar os mesmos procedimentos utilizados para C. canephora em agregados celulares de C. arabica, foram obtidos cromossomos metafásicos e prometafásicos apresentando resolução suficiente para realização das análises citogenéticas e para montagem do cariograma da espécie. As análises morfométricas evidenciaram tanto cromossomos morfologicamente idênticos quanto diferentes, sugerindo que C. arabica é um alotetraplóide, não segmental, formado a partir do cruzamento de duas espécies com genoma similar. A citometria de fluxo foi empregada para mensurar o conteúdo de DNA nuclear e determinar a composição de bases de C. canephora e C. arabica. Análises preliminares mostraram que os procedimentos envolvendo o uso dos tampões OTTO e de compostos antioxidantes resultaram histogramas apresentando picos de núcleos em G0/G1 com coeficientes de variação considerados adequados para análises citométricas. Além disso, foi demonstrado que, em comparação com Pisum sativum e Raphanus sativus, Solanum lycopersicum foi a planta utilizada como padrão de DNA conhecido que gerou as estimativas mais acuradas acerca do conteúdo de DNA nuclear de C. arabica e C. canephora. Numa segunda etapa foi verificado que o tamanho médio do genoma nuclear de C. arabica (2,62 picogramas) e C. canephora (1,41 picogramas) obtido por meio do fluorocromo iodeto de propídeo foi idêntico ao mensurado com núcleos corados com SYBR Green I. Entretanto, o corante SYBR Green I proporcionou análises citométricas mais precisas, visto que os picos gerados por núcleos na fase G0/G1 apresentaram coeficientes de variação abaixo dos obtidos com iodeto. Além do conteúdo absoluto de DNA, a composição de bases também foi mensurada para as duas espécies utilizando núcleos corados com 4’,6’-diamidino-2-fenilindole (DAPI) e cromomicina A3 (CMA3). C. arabica apresentou um percentual de bases AT equivalente a 63,04% e GC 36,96%, enquanto o percentual de base AT de C. canephora foi 65,27% e GC 34,73%. A associação de metodologias citogenéticas e citométricas de fluxo e imagem permitiu estimar o conteúdo de DNA de cada cromossomo de C. arabica e C. canephora. Os resultados obtidos também mostraram que C. arabica é um verdadeiro allotetraplóide e geraram evidências que C. canephora é um possível progenitor dessa espécie. Os dados apresentados forneceram novas informações acerca das características, composição e organização do genoma de C. arabica e C. canephora e representam um avanço na prospecção do genoma do cafeeiro.