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Análise de expressão diferencial de proteases em sementes de Coffea arabica
(2007) Yamamoto, Paula Yuri; Nobile, Paula Macedo; Abreu, Hellen Marília Couto de; Mazzafera, Paulo; Colombo, Carlos Augusto; Embrapa - Café
Cafés colhidos em regiões mais quentes apresentaram diferenças marcantes na qualidade da bebida ao mesmo tempo que níveis diferenciados de atividade de proteases. Diante dessas evidências observadas em nossos laboratórios, o presente estudo teve por objetivo estudar a expressão de genes envolvidos na produção de proteases em frutos de uma mesma variedade de café em diferentes estádios de desenvolvimento e de dois locais edafoclimaticamente distintos (Adamantina e Mococa). Cinco genes representando proteases do grupo asparagina e cisteína foram adotados para estudo de expressão diferencial em função de terem sido encontrados apenas em bibliotecas de fruto do banco de ESTs do Genoma café. Paralelamente, foram testados quatro genes constitutivos para serem utilizados como normalizadores da técnica de RT-PCR em frutos de café, tendo sido adotados GPDH C e CyP. As maiores diferenças de expressão foram observadas entre os diferentes estádios de maturação (frutos verdes e cerejas). Dentre os frutos coletados em Mococa, o verde expressou até 13,93 vezes mais que o cereja para o gene de Cis 5. Por outro lado, essa diferença de expressão não foi observada entre os dois estádios de maturação dos frutos de Adamantina. O gene Cis 8 de fruto verde foi mais expresso em ambas as localidades. O gene de Cis 22 apresentou menor taxa de transcrição no fruto verde que em fruto cereja, nas duas localidades avaliadas. Estes dados mostram que as transcrições desses genes variam durante a maturação dos frutos do café e provavelmente são influenciadas pelas condições ambientais de cultivo. Para avaliar a expressão diferencial das proteases em locais de cultivo que apresentam temperaturas contrastantes foram utilizados frutos em mesmo estádio de desenvolvimento, variando apenas a localidade. Três genes de cisteína revelaram valores significativos de diferença de expressão em Adamantina em relação a Mococa. No estádio cereja foi detectada uma diferença de expressão de protease aproximadamente 5 vezes maior em Adamantina em relação a Mococa para o gene Cis 5. Ao contrário, nos frutos verdes a expressão da Cis 5 foi em média três vezes maior em Mococa, onde a temperatura média anual é mais baixa do que em Adamantina. O gene similar a Cis 5, que codifica uma cisteina endopeptidase do tipo papaína do grão de mamona (Ricinus communis L.) possui a capacidade de processar o precursor da proteina glyoxysomal malate dehydrogenase e a literatura sugere que esta enzima tem como função transferir os metabólicos de um tecido para outro emergente. Apesar da influência das proteases na qualidade de bebida do café ainda dependa de análises bioquímicas e sensoriais, foi possível elucidar o estabelecimento de uma estreita relação na expressão dessas enzimas com fatores ambientais.
Análise in silico do metabolismo do fitato e da ferritina em Coffea
(2007) Quecini, Vera; Nobile, Paula Macedo; Colombo, Carlos Augusto; Mazzafera, Paulo; Embrapa - Café
O presente trabalho teve por objetivo empregar ferramentas de bioinformática em análises in silico para investigar o metabolismo do fator antinutricional fitato e da família de proteínas associadas a este composto por ação quelante, a ferritina. A maior parte dos componentes caracterizados do metabolismo fitato-ferritina foi encontrada nos bancos de dados do Genoma do Café. Transcritos semelhantes às duas principais famílias do metabolismo do fitato foram encontrados em Coffea. Interessantemente, conforme descrito em Arabidopsis, estas proteínas de café também parecem ter uma divergência funcional, estando algumas associadas ao acúmulo de reservas energéticas nas sementes e as demais, induzidas em condições de estresse biótico e abiótico. Em café, a família das ferritinas é divergente da família de Arabidopsis, sendo os componentes mais semelhantes entre si do que aos ortólogos da planta-modelo. As descobertas do presente trabalho demonstram o poder e a transferibilidade de informações funcionais de sistemas-modelo para culturas de importância econômica.
Caracterização de linhagens comerciais de café através de marcadores moleculares
(2000) Silvestrini, Milene; Maluf, Mirian Perez; Ruggiero, Luciana Machado de Campos; Guerreiro, Oliveiro; Colombo, Carlos Augusto; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
Estudos sobre a diversidade genética de espécies com finalidade de melhoramento genético representam importante preocupação dos melhoristas. Diversas técnicas moleculares têm permitido revelar uma diversidade genética presente no genoma que até então era desconhecida pelos cientistas. Muitas espécies de interesse agronômico têm sido alvo de estudos que abordam a diversidade genética em nível molecular. De uma maneira geral, os resultados obtidos a partir do uso dos marcadores têm sido bastante satisfatórios, principalmente para aquelas espécies que apresentam ampla base genética e insuficiente número de descritores botânicos para diferenciação de genótipos, como é o caso da mandioca. A base genética formada pelos cultivares de C. arabica, principal espécie cultivada, é considerada estreita. Em relação ao Brasil, principal produtor mundial desta cultura, a própria história explica em parte a ausência de variação genética nos materiais atualmente em cultivo. Historicamente, as primeiras plantações de café formaram-se há mais de dois séculos a partir de poucas plantas, constituindo material muito uniforme e de pouca variabilidade genética. De fato, estudos sobre a diversidade genética de cafeeiros em cultivo realizados no IAC utilizando descritores botânicos e agronômicos têm revelado baixo nível de variação genética entre as diferentes linhagens que compõem um cultivar. Entre diferentes cultivares esta variação é mais notória, mão não tão acentuada como se pensava, mesmo quando diferentes espécies participam da genealogia destes cultivares. Desta maneira, este trabalho teve como objetivo principal a avaliação das técnicas de RAPD e AFLP para a identificação e caracterização de diversas linhagens comerciais de C. arabica selecionadas pelo IAC. Os resultados obtidos com estes marcadores confirmam os dados obtidos anteriormente de que a variabilidade genética entre as linhagens é pequena. Além disso, os dados sugerem que a técnica de RAPD não é eficiente para a identificação e determinação da distância genética entre as linhagens avaliadas, apesar de representar uma ferramenta adequada para avaliação da variabilidade no cafeeiro. No entanto, embora o nível de variação observado através dos marcadores moleculares seja baixo, sabe-se que estas linhagens apresentam comportamento agronômico bastante diferenciado. Isso nos leva a pensar que poucos genes diferenciam os principais materiais genéticos de cafeeiro de importância agronômica e que o uso de marcadores moleculares para estudos de diversidade genética e localização de genes de interesse agronômico deve ser repensada.
Caracterização molecular de variedades elite de Coffea arabica L. através de marcadores AFLP
(2001) Ruggiero, Luciana Machado de Campos; Colombo, Carlos Augusto; Maluf, Mirian Perez; Guerreiro, Oliveiro; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
Ao longo de 70 anos de pesquisas voltadas para o melhoramento genético do cafeeiro, o Instituto Agronômico de Campinas (IAC) acumulou importante germoplasma desta cultura. Diversos cultivares foram selecionados e vêm sendo cultivados não apenas no Brasil, como também em vários países cafeicultores. No caso da espécie C. arabica, uma das dificuldades surgidas com o crescente número de cultivares obtidos está relacionada à correta identificação das linhagens que o compõem, freqüentemente de parentesco muito próximo, o que torna difícil a diferenciação destes através dos descritores botânicos e agronômicos. Diante desse contexto, a caracterização das principais linhagens dos cultivares Mundo Novo, Acaiá, Catuaí Vermelho, Catuaí Amarelo, Icatu Vermelho, Icatu Amarelo, Icatu Precoce, Bourbon Amarelo, Ouro Verde e Obatã, de C. arabica, vem sendo realizada utilizando-se a técnica AFLP (Amplified Fragment Lenght Polimorfism). Os fragmentos obtidos foram visualizados em gel de acrilamida 5%, através da marcação dos primers com fluorescências específicas e da utilização de seqüenciador automático (ABI 377). Até o momento, 663 fragmentos foram obtidos e analisados em função da presença ou ausência das bandas geradas. Utilizando-se o aplicativo NTSYs, foi calculado um índice de similaridade genética (Jaccard) e a partir dele construído um dendrograma (UPGMA). Os resultados obtidos até o presente momento atestam a grande quantidade de informações geradas por esse tipo de marcador. Todas as linhagens utilizadas no presente estudo foram diferenciadas umas das outras em pelo menos 10% do total de bandas polimórficas utilizadas para as análises. No entanto, as relações de parentesco não são coerentes com as informações sobre a origem genética destas, sugerindo que novos marcadores sejam obtidos.
DETECÇÃO DE POLIMORFISMO DE ÚNICA BASE (SNPs) PELAS TÉCNICAS DE PCR- RFLP E ARMS-PCR NO CAFÉ
(2011) Schincariol, Luciana Pasqualini; Yamamoto, Paula Yuri; Colombo, Carlos Augusto; Embrapa - Café
O desenvolvimento de mapas genéticos é uma das aplicações de maior impacto da tecnologia de marcadores moleculares quando o interesse é a localização de genes que controlam características de importância econômica, como produção de grãos, qualidade, altura de planta, teor de proteína, resistência a doenças, etc. Elas resultam da ação cumulativa de um conjunto de genes e tais características são denominadas poligênicas e os locos que as controlam chamados de QTL. Apesar da sua importância econômica de destaque, há poucos estudos de mapas genéticos associados a marcadores moleculares no cafeeiro. O crescente interesse sobre a qualidade de bebida no café estimula a utilização de marcadores moleculares para utilização em práticas de seleção assistida. Uma classe importante de marcadores moleculares consiste no polimorfismo de nucleotídeo único (SNPs e INDELs) derivado de diferenças em um único par de bases na seqüência do DNA de indivíduos de uma mesma espécie. Como constituem as formas mais abundantes de variações do genoma, os SNPs podem fornecer uma fonte para saturação de mapas genéticos, aumentando sua precisão. Assim, o presente estudo teve por finalidade detectar e validar marcadores do tipo SNPs derivados de genes envolvidos com qualidade de bebida em café para fins de mapeamento.
Efeito da temperatura em aminoácidos e proteases de café
(2005) Shimizu, Milton Massao; Silva, Emerson Alves da; Mazzafera, Paulo; Colombo, Carlos Augusto; Baptista, Guilherme G.; Embrapa - Café
Frutos de café foram mantidos em uma armação plástica, de forma a aumentar a temperatura durante o seu desenvolvimento. Frutos foram coletados verdes e maduros, sendo que como testemunhas foram coletados frutos a pleno sol e da sombra, sob a saia do cafeeiro. O endosperma dos frutos foi retirado para análise de aminoácidos e de proteases. Aminoácidos variaram bastante no aspecto quantitativo e qualitativo. Proteases foram caracterizadas quando à inibição por inibidores específicos para esta classe de enzimas e mostrou-se a presença de serino-proteases no endosperma de café. Discute-se preliminarmente os resultados em relação ao efeito da temperatura na alteração do padrão de compostos nitrogenados e sua relação com a qualidade da bebida.
Genetic diversity of cultivated Coffea arabica inbred lines assessed by RAPD, AFLP and SSR marker systems
(Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", 2005-07) Maluf, Mirian Perez; Silvestrini, Milene; Ruggiero, Luciana Machado de Campos; Guerreiro Filho, Oliveiro; Colombo, Carlos Augusto
One of the greatest problems in Coffea arabica breeding is identifying precisely any inbred line, based only on botanical and agronomical descriptors, because of the reduced genetic variability of the species, close pedigree origin, which results in small phenotypic variation. Recently, molecular markers have been used for plant germplasm characterization and identification in several commercial species. This work evaluates the reliability of three marker systems: RAPD, AFLP and SSR, to characterize the genetic variability of commercially-used Coffea inbred lines developed by the Instituto Agronômico (IAC), and their potential for cultivar identification. All methods identified polymorphisms among the cultivars. The genetic diversity recognized by the methods is very similar, although is very narrow. RAPD and SSR marker systems grouped more efficiently the evaluated cultivars according to parental origin. None of the methods allowed inbred line identification. Therefore for varietal protection, it would be necessary using a combination of botanical, agronomical and molecular markers descriptors for precise cultivar identification.
Identificação e caracterização de ESTs presentes no banco do genoma café relacionados a proteases
(2005) Baptista, Guilherme G.; Mazzafera, Paulo; Priolli, Regina H. G.; Shimizu, Milton Massao; Schocken, Natalie R. Leóz; Colombo, Carlos Augusto; Embrapa - Café
Evidências recentes indicam que proteases podem ter importante papel na qualidade de bebida de cafeeiros cultivados em regiões com temperaturas médias anuais contrastantes. Assim, o objetivo do presente trabalho foi identificar ESTs apresentando alta similaridade com proteases no banco de dados do Projeto Genoma Café. Cerca de 1800 reads foram identificados e blastados. Contigs contendo em sua maioria seqüências de bibliotecas de frutos foram classificadas nos em serinas, cisteínas, aspárticas e metalo proteinases. Em seguida tais contigs foram submetidos a uma análise filogenética com seqüências similares encontradas em bancos públicos como também identificados os domínios funcionais das mesmas. Primers para amplificação destes domínios foram desenhados e o próximo passo será verificar o nível de expressão destes genes em endospermas de frutos de café provenientes de locais com temperaturas contrastantes.
NOVOS MARCADORES PARA FINS DE MAPEAMENTO E LOCALIZAÇÃO DE QTLs A PARTIR DE PCR-RFLP DE GENES DO GENOMA CAFÉ BRASILEIRO
(2009) Colombo, Carlos Augusto; Yamamoto, Paula Yuri; Ramos, Luis Carlos S.; Mazzafera, Paulo; Gallo, Paulo Boller; Vilella, Otávia T.; Lannes, Sérgio D.; Pot, David; Ferreira, Lucia P.; Vieira, Luiz Gonzaga E.; Pereira, Luiz Filipe P.; Embrapa - Café
O mapeamento genético é uma das estratégias mais visadas para fins de melhoramento genético e ganha maior importância a partir do surgimento de marcadores do tipo SNPs ou INDELs, facilitado pelos projetos genomas, sobretudo de ESTs. Assim, análises in silico de busca de polimorfismo SNPs em seqüências relacionadas com qualidade de bebida e derivadas de C.arabica e C.canephora foram analisadas e o polimorfismo entre as duas espécies validado para seis genes (quatro proteases e dois de sacarose) a partir de estudos de laboratório utilizando a técnica PCR-RFLP. Para tanto, após confirmação do polimorfismo nas duas espécies parentais, foram genotipadas 90 plantas F2 derivadas da autofecundação de um híbrido interespecífico de Coffea arabica e C. canephora 4x. Após a obtenção dos amplificados, estes foram digeridos com diversas enzimas de restrição de quatro bases (Alu I, Dde I, Eco RI, Hae III, Mse I e Msp, Fnu DII, Taq I; Scr FI). Dos seis genes analisados, quatro deles apresentaram segregação do tipo 3:1 na população F2 (Cisteína 8, Cisteína 5, β-Fructosidase e Sacarose Fosfato Sintase), demonstrando a utilização dos mesmos para fins de mapeamento.
OBTENÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES POR MEIO DE PCR-RFLP DE GENES RELACIONADOS COM QUALIDADE EM CAFÉ
(2009) Villela, Otávia T.; Lannes, Sérgio Dias; Pot, David; Ferreira, Lucia P.; Priolli, Regina Helena G.; Ramos, Luis Carlos S.; Colombo, Carlos Augusto; Vieira, Luiz Gonzaga E.; Pereira, Luiz Filipe P.; Embrapa - Café
A qualidade de bebida do café é fator fundamental para sua comercialização, pois agrega valor ao produto, garantindo maior competitividade e melhores preços no mercado. A composição química do café é um dos fatores que determinam a qualidade da bebida. Seu sabor e seu aroma são resultantes da presença combinada de vários constituintes, dentre os quais os ácidos clorogênicos, os diterpenos e os açúcares. O objetivo deste trabalho foi buscar polimorfismos a partir de PCR-RFLP utilizando primers baseados em sequências ESTs de genes relacionados com a qualidade de bebida. Para isso foi utilizado o DNA de uma população F 2 formada a partir da autofecundação de um híbrido interespecífico de Coffea arabica e C. canephora. Os resultados revelaram um total de doze marcas polimórficas na população. Dentre essas marcas, quatro foram obtidas através da presença e da ausência da amplificação dos genes. Oito combinações polimórficas foram obtidas através da clivagem do produto de PCR por quatro enzimas de restrição (TaqI, BsuRI, RsaI e HhaI). Com a validação dos polimorfismos encontrados nos amplicons, essas marcas estão sendo utilizadas para trabalhos de mapeamento na população de arabustas com objetivo de identificar QTLs relacionados à concentração de compostos como cafeína, ácidos clorogênicos, diterpenos, açúcares, bem como de proteases.
Polimorfismo de locos SSR e coeficiente de similaridade genética em populações segregantes de C. arabica x C. canephora
(2005) Priolli, Regina H. G.; Möller, Milene; Ramos, Luís Carlos da Silva; Zucchi, Maria I.; Mazzafera, Paulo; Colombo, Carlos Augusto; Embrapa - Café
O polimorfismo e segregação de locos microssatélites foram analisados em 148 indivíduos F2 e 72 RC1 de C. arabica x C. canephora no intuito de ser construído um mapa de ligação molecular. Quinze dos 17 locos analisados, totalizando 40 alelos foram validados para estudos de mapeamento. O coeficiente de similaridade genética (Jaccard) variou de 0,69 a 1,00 para o F2 e 0,84 a 1,0 para o RC1 com apenas dois perfis moleculares idênticos no F2 e dois no RC1. Estes resultados sugerem que há variabilidade genética suficiente dentro das populações segregantes para os estudos de mapeamento e conseqüente associação destes marcadores a caracteres de importância agronômica.
VARIABILIDADE GENÉTICA DE GENÓTIPOS DE COFFEA ARABICA EM RESPOSTA À PRESENÇA DO AL NO SISTEMA RADICULAR
(2009) Eiras, Ariane de Lima; Nobile, Paula Macedo; Gallo, Paulo Boller; Mistro, Julio C.; Siqueira, Walter José; Colombo, Carlos Augusto; Embrapa - Café
As principais regiões produtoras de café no Brasil estão localizadas em solos ácidos, que possuem teores de alumínio trocável (Al+3) em quantidades suficientes para alterar o crescimento de muitas espécies de plantas cultivadas. O alumínio atua primariamente no sistema radicular das plantas retardando o crescimento e o desenvolvimento deste, promovendo a diminuição do número de raízes laterais, as principais responsáveis pela absorção de água e nutrientes, e o comprometimento da produção vegetal. Embora exista um número razoável de pesquisas a respeito dos efeitos tóxicos do alumínio e dos mecanismos de tolerância a este íon em várias plantas de valor econômico, poucos são os trabalhos que relatam seus efeitos na planta e genética molecular do cafeeiro. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo a identificação de genótipos de café sensível e tolerante ao Al para que estas possam ser utilizadas em estudos posteriores de expressão diferencial e identificação de genes potencialmente relacionados à tolerância desta cultura a este íon. Para isto, cinco cultivares economicamente importantes de Coffea arabica foram crescidas em meios nutritivos com 0,000mM, 0,075mM e 0,370mM de AlCl 3. Dentre as variedades estudadas, Obatã IAC 1669-20 e Catuaí Amarelo IAC 62 mostraram maior tolerância, enquanto Icatu IAC 4045 mostrou maior sensibilidade ao Al. Os resultados obtidos reforçam a toxicidade do Al no sistema radicular do cafeeiro e a existência de uma variabilidade genética de Coffea arabica relacionada a tolerância ao íon em questão.