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Análise da expressão dos genes Baby Boom (BBM) e Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinase (SERK) envolvidos na embriogênese somática do cafeeiro (Coffea arabica L.)
(Universidade Federal de Lavras, 2011-02-25) Silva, Anderson Tadeu; Paiva, Luciano Vilela
Retrata-se, neste estudo, os genes identificados e caracterizados na embriogênese somática de Coffea arabica L. cv Catiguá conduzidos no Laboratório Central de Biologia Molecular (LCBM), na Universidade Federal de Lavras (UFLA), Minas Gerais. A embriogênese somática – formação do embrião a partir de células somáticas é um mecanismo de reprodução assexuada natural em algumas espécies vegetais, mas que pode ser induzido in vitro de modo generalizado. Análises histológicas das características diferenciadoras entre células somáticas e embriogênicas podem ser usadas para aumentar a eficiência metodológica, porém, não permitem o diagnóstico dos eventos indutores da transição entre essas características e, portanto, o estudo e obtenção de marcadores moleculares ligados aos eventos de transição são de extrema utilidade. Nesse contexto, foi avaliada a expressão in silico e in vitro dos genes SERK (Somatic Embryogensesis Receptor Kinase) e BBM (Baby Boom), envolvidos no processo de transição do estado vegetativo para o embriogênico, visando à expressão diferencial “in vitro” e também a busca por um marcador molecular, mediante análises in silico. No artigo 1 apresenta-se a expressão diferencial do gene SERK nos estágios de calos embriogênicos, calos não embriogênicos e suspensão celular. Um total de três ESTs-contigs foram analisados, em que o ESTs-contig 166 apresentou, em sua expressão, características diferenciadas para a embriogênese de café. Esses dados sugerem que o ESTs-contig 166 seja o possível ortólogo de SERK em C. arabica (CaSERK) e indicam que essa estratégia pode aumentar ainda mais a eficiência metodológica para a obtenção de suspensão de células embriogênicas - ECS, em outras espécies e cultivares . No artigo 2 apresenta-se a expressão diferencial do gene BBM nos estágios de calos embriogênicos, calos não embriogênicos e suspensão celular. Um total de dois ESTs-contigs foram analisados, em que o ESTs-contigs 9 apresentou uma alta e exclusiva expressão nos estágios de calos embriogênicos e suspensão celular, em relação aos calos não embriogênicos. Esses dados sugerem que ESTs-contig 9 seja o possível ortólogo de BBM em C. arabica (CaBBM) e indicam que o uso dele como marcador molecular pode aumentar ainda mais a eficiência metodológica durante a obtenção de materiais embriogênicos de cafeeiro. Pelo artigo 3 indica-se uma relação transiente de indução e retroinibição entre CaBBM e CaSERK durante a curva de crescimento das ECS, na qual a expressão diametralmente opostas entre eles coincide com a estabilização da taxa de crescimento das ECS. No artigo 4 apresenta-se a possíbilidade de cinco ESTs-contigs identificados in silico nas bibliotecas de cafeeiro, também serem usados como marcadores do processo de aquisição embriogênica.
Análise da variabilidade de sequências no gene DREB1D em diferentes genótipos do gênero Coffea
(Embrapa Café, 2013) Alves, Gabriel Sérgio Costa; Freire, Luciana Pereira; Vieira, Natália Gomes; This, Dominique; Pot, David; Marraccini, Pierre; Paiva, Luciano Vilela; Andrade, Alan Carvalho
Em várias espécies vegetais, os genes DREB desempenham um papel importante na resposta aos estresses abióticos. A obtenção de marcadores de diversidade fenotípica para assistir aos programas de melhoramento genético é prioritário. Neste contexto, o conhecimento da correlação entre polimorfismo genético e o mecanismo de tolerância à seca pode representar um avanço significativo para o melhoramento de plantas cultivadas. Assim, visando estudar a variabilidade genética presente no gene DREB1D e desenvolver marcadores funcionais para alelos efetivos, polimorfismos foram caracterizados e identificados após análises de sequências alélicas isoladas de diferentes genótipos do gênero Coffea. As análises permitiram identificar polimorfismos na região promotora e codante do gene DREB1D de C. canephora (CcDREB1D), nos seus ortólogos e homoeólogos. Os polimorfismos encontrados possibilitaram a identificação de diferentes haplótipos. As variações de sequência ortóloga (OSVs) entre C. canephora e C. eugenioides, assim como, as variações nucleotídicas únicas de homoeólogos (HSVs) entre os subgenomas de C. arabica, C. canephora (CaCc) e C. eugenioides (CaCe) são apresentadas para o desenvolvimento de marcadores alelo-específico e homoeólogo-especifico para este locus.
Avaliação do potencial embriogênico de suspensões celulares de Coffea arabica
(Universidade Federal de Lavras, 2013) Torres, Luana Ferreira; Paiva, Luciano Vilela
A suspensão de células embriogênicas (ECS) é iniciada pela inoculação de calos friáveis em meio líquido e sob agitação constante, se mostrando como um sistema de propagação in vitro bastante eficiente para aplicações biotecnológicas. As análises da morfologia das células e a caracterização ultraestrutural, por meio das microscopias fotônica e eletrônica, permitem visualizar a transição das células somáticas para embriogênicas, através das características diferenciadoras entre as células, inferindo se o material possui potencial embriogênico. Além disso, o uso de genes marcadores moleculares estádio-específicos apresenta-se como estratégia para o estudo dos processos da embriogênese somática, permitindo uma melhor compreensão dos aspectos moleculares desses processos de desenvolvimento, além de propiciar a possibilidade de otimização de sistemas e protocolos de embriogênese somática. No capítulo 2, objetivou-se relacionar a estrutura morfológica e ultraestrutural de ECS de Coffea arabica cv. Bourbon com seu potencial embriogênico, através da curva de crescimento e das microscopias fotônica, de varredura e de transmissão. No período analisado, a curva de crescimento da ECS apresentou três fases distintas: lag (0 a 4 dias), exponencial (4 a 20 dias) e desaceleração (20 a 28 dias). Os procedimentos de subcultivos para manutenção e multiplicação das ECS devem ocorrer ao final da fase exponencial ou início da fase de desaceleração, bem como a renovação do meio de cultivo. Dois tipos celulares foram identificados: Tipo 1, apresentou características altamente embriogênicas, tais como: células pequenas com citoplasma denso, ausência de grandes vacúolos, núcleo grande e nucléolos proeminentes e presença de grãos de amido; Tipo 2, apresentou células grandes, dispersas, vacuoladas, com ausência de núcleos, pouca ou nenhuma presença de grãos de amido. A análise por MEV das amostras com quatro dias mostrou a presença de células arredondadas e isodiamétricas, formando os aglomerados celulares e menor frequência de células murchas, além da presença de células em divisão. Nas amostras com 28 dias notou-se a presença de células assimétricas, murchas e rompidas. As análises por MET permitiram visualizar na amostra de 4 dias, células com núcleo e nucléolo proeminente, alta razão núcleo/citoplasma, abundante presença de amiloplastídeos e parede celular com pequenos espaços intercelulares. Nas amostras de 28 dias, a grande presença de vacúolos, alguns ocupando quase que totalmente o citoplasma, grandes espaços intercelulares e ausência de conteúdo celular. No capítulo 3, objetivou-se relacionar a renovação do meio nutritivo com a morfologia das células e a expressão dos genes SERK e BBM de ECS de Coffea arabica cv. Catiguá. Todas as ECS coletadas (30, 45, 60 e 75 dias) possuíam significativos aspectos embriogênicos, exceto aos 75 dias, que também apresentou materiais com características não embriogênicas. Com relação à expressão dos genes marcadores, as análises de expressão sugerem uma relação transiente de indução entre SERK e BBM durante o crescimento da suspensão celular. A renovação quinzenal de 90% do meio de cultura ocasiona um nível de estresse às células, com relação direta na expressão dos genes, ou seja, não permite aos genes sua expressão natural.
Características histo-anatômicas dos calos a partir de embriões zigóticos imaturos de Coffea arabica L. cv. Rubi
(Embrapa Café, 2015) Lacerda, Guilherme Araújo; Oliveira e Silva, Brenda de; Chalfun Junior, Antonio; Paiva, Luciano Vilela
Com o objetivo de estudar o processo de calogênese utilizando-se embriões zigóticos imaturos de cafeeiro C. arabica L. cv. Rubi como fonte alternativa de explantes, foi realizado o presente trabalho. Foram coletados frutos de cafeeiro C. arabica L. cv. Rubi em estádio verde-cana e mantidos em sacos de papel, por 24 horas, sob refrigeração (4ºC). Os frutos foram desinfestados com hipoclorito de sódio comercial 70% (v/v) durante 30 minutos, em câmara de fluxo laminar e lavados 3 vezes em água destilada e autoclavada. Em seguida, os embriões foram isolados utilizando-se placas de Petri esterilizadas contendo papel filtro e água destilada e autoclavada. Para induzir a calogênese, foi realizada uma incisão no hipocótilo do embrião zigótico imaturo no momento de sua excisão do fruto. Calos provindos de plantas de cafeeiro com um ano de estabelecimento foram observados quanto aos seus aspectos histo-anatômicos. Foram feitos cortes transversais corados com safrablau (safranina e azul de astra) e observados e fotografados em microscópio fotônico. Foi observado, ao MEV, que as células acumulam grande quantidade de amiliplastídeos, sugerindo que os grãos de amido podem ser utilizados como marcadores iniciais do potencial embriogênico. A microscopia fotônica revelou que os calos provindos de embriões zigóticos apresentam-se como uma fonte de explante responsiva à embriogênese, mostrando indícios de formação de embriões somáticos.
CARACTERIZAÇÃO DA REGIÃO PROMOTORA DO GENE DREB2A DE GENÓTIPOS DE COFFEA CANEPHORA CONTRASTANTES PARA A TOLERÂNCIA À SECA
(2011) Alves, Gabriel Sérgio Costa; Freitas, Luciana Pereira; Heimbeck, Ingrid Gomes Renoldi; Vieira, Natália Gomes; Vinecky, Felipe; Marraccini, Pierre; Paiva, Luciano Vilela; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
Apesar de alguns estudos em fisiologia vegetal resultarem em uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na tolerância à seca em cafeeiro, ainda é escasso o conhecimento acerca das alterações metabólicas e moleculares envolvidos na resposta do cafeeiro às condições de estresse hídrico. Neste sentido, resultados prévios obtidos, analisando-se a expressão relativa do gene DREB2A dos clones 14 (tolerante a seca) e 22 (sensível a seca) de Coffea canephora var. Conilon, demonstraram expressão diferencial desse gene em folhas de plantas submetidas ou não ao estresse hídrico. Polimorfismos na região promotora do gene DREB2A foram identificados e podem indicar a participação de diferentes haplótipos no controle genético da tolerância a seca. O objetivo deste trabalho consiste na engenharia de cassetes gênicos utilizando o vetor binário pBI121 combinado com diferentes segmentos da região promotora do gene DREB2A, isolados dos clones 14 e 22 de C. canephora com o intuito de permitir uma melhor caracterização in vivo, da participação dos elementos cis e da influência dos polimorfismos observados na funcionalidade deste promotor em relação às respostas do cafeeiro ao estresse hídrico.
Caracterização de suspensões celulares e obtenção de sementes sintéticas de Coffea arabica cv. Catiguá
(Universidade Federal de Lavras, 2014-08-22) Ribeiro, Luciene de Oliveira; Paiva, Luciano Vilela
Objetivou-se nesse trabalho analisar as características histológicas, moleculares e a capacidade de regeneração de suspensões celulares embriogênicas, bem como a otimização de um protocolo para produção de sementes sintéticas a partir de embriões somáticos de C. arabica cv. Catiguá. Não foram observadas diferenças nos aspectos histológicos das amostras analisadas, bem como na relação da expressão dos genes analisados com o potencial regenerativo das ECS. Contudo, foi possível observar uma relação transiente de indução entre BBB e SERK, altos níveis de expressão de SERK nos diversos estádios de desenvolvimento dos embriões, níveis basais de expressão do WUS em todas as amostras de ECS mostrando-se significativamente expresso a partir do estádio cordiforme/torpedo. Foi possível identificar que linhagens de ECS tidas como embriogênicas pelo aspecto visual não se comportaram da mesma maneira quanto aos padrões de regeneração. Nas pesquisas realizadas observou-se que a maturação dos embriões em meio MGM líquido é favorável para a obtenção de embriões somáticos no estádio torpedo e cotiledonar, frente a este mesmo meio no estado sólido. Em relação à produção de sementes sintéticas, resultados apontam para a utilização da técnica convencional de encapsulamento, porém com a adição de solução nutritiva DEV na matriz de encapsulamento, para uma taxa de conversão das sementes sintéticas em plântulas de 77,5%.
Caracterização funcional de genes da família multdrug and toxic compound extrusion (MATE) envolvidos na adaptação de Coffea arabica à solos ácidos
(Universidade Federal de Lavras, 2016-09-06) Pinto, Renan Terassi; Paiva, Luciano Vilela
A partir da expansão da fronteira agrícola, o cultivo de espécies do gênero Coffea expandiu-se para áreas marginalizadas em termos de fertilidade de solos, como o Cerrado brasileiro. Os primeiros trabalhos relacionados ao levantamento das características deste ambiente evidenciaram, dentre outros aspectos, os problemas relacionados à toxidez do alumínio e a baixa disponibilidade de fosfatos. Apesar das técnicas aplicadas para a correção destes problemas serem amplamente difundidas, estas não são facilmente aplicadas em cultivos perenes e, além disso, baseiam-se na alteração do ambiente para o cultivo do vegetal, o que pode culminar em impacto ambiental. Dessa forma, o estudo dos mecanismos moleculares relacionados à adaptação pode impulsionar o desenvolvimento de programas de melhoramento genético, convencional e baseado em biotecnologia, que culminem na manutenção da produtividade do setor cafeeiro de forma sustentável. Neste contexto, a partir deste trabalho, objetivou-se elucidar os membros da família gênica Multi drug and toxic compound extrusion (MATE) em Coffea canephora afim de identificar, dentre os diversos membros desta família multifuncional, genes relacionados à tolerância ao alumínio e analisar a influência destes genes sobre os mecanismos de tolerância à este estresse em Coffea arabica. O estudo in silico da família MATE possibilitou a identificação de 60 proteínas presentes em C. canephora. Destacaram-se as proteínas CcMATE7 e CcMATE43 provavelmente relacionadas ao transporte de alcalóides em C. canephora, também alguns potenciais transportadores de flavonóides, CcMATE18 e CcMATE20 e a proteína CcMATE42, potencialmente associada ao efluxo do ânion citrato, que pode minimizar os efeitos tóxicos do alumínio solúvel e auxiliar a absorção de fosfatos. A partir deste candidato em potencial, foram identificados dois genes homeólogos em C. arabica, um relacionado ao subgenoma derivado do ancestral C. canephora (CaMATE_C) e outro do ancestral C. eugenióides (CaMATE_E). A partir de um experimento em hidroponia, foi demonstrado por RT-qPCR que estes homeólogos apresentam perfis distintos de expressão gênica sob estresse causado por exposição ao alumínio. O gene CaMATE_E foi considerado mais responsivo à este estímulo e com perfil de expressão condizente com a exsudação de citrato, mesmo não havendo elementos cis-regulatórios especificamente relacionados à tolerância à alumínio que expliquem esta diferença. Em conclusão, este trabalho pode fornecer informações relevantes para os estudos relacionados aos mecanismos de adaptação de espécies do gênero Coffea à solos ácidos, sendo estes pertinentes para o cultivo produtivo e sustentável do cafeeiro neste ambiente.
Drying of arabica coffee and its effect on the gene expression and activity of enzymes linked to seed physiological quality
(Editora da Universidade Estadual de Maringá - EDUEM, 2023) Carvalho, Mayara Holanda de; Rosa, Sttela Dellyzete Veiga Franco da; Coelho, Stefânia Viias Boas; Guimarães, Cristiane Carvalho; Martins, Rayana de Sá; Clemente, Aline da Consolação Sampaio; Paiva, Luciano Vilela
The reduced longevity of coffee seeds has been attributed to their sensitivity to desiccation. Studies related to gene expression and enzyme activity in coffee seeds under drying are important for understanding the effects of drying on their physiological quality. The aim of this study was to investigate the molecular aspects of seeds under different drying methods and associate them with physiological quality. Coffee seeds with different water contents were dried both slowly and rapidly. Enzymatic activity was analysed, as well as the expression of genes that encode the enzymes superoxide dismutase, catalase, peroxiredoxins, isocitrate lyase, and endo-ß-mannanase. There was a significant effect of drying speed and final water content on enzyme activity and on the expression of the different genes analysed. In seeds under rapid drying, there was greater expression of the genes that encode the enzymes catalase and endo-ßmannanase. Greater expression of the 1 CYS PRX and SOD genes and greater activity of the ICL isoenzymes were found in seeds with superior physiological quality, but greater activity of the endo-β-mannanase and CAT enzymes occurred in seeds with lower physiological quality.
Efficiency of RNA extraction protocols in different types of coffee plant tissues
(Editora UFLA, 2012-09) Paula, Márcia Fabiana Barbosa de; Ságio, Solange Aparecida; Lazzari, Fabiane; Barreto, Horllys Gomes; Paiva, Luciano Vilela; Chalfun-Junior, Antonio
In order to use sensitive techniques of molecular biology, such as the study of differentially expressed genes, a high- quality RNA in suitable quantities is necessary. Due to the presence of several varieties and often expressive quantities of secondary compounds in plants, there is no standard method for the isolation of nucleic acids that can be used for all species. Polyphenols and polysaccharides are the compounds that interfere the most in the extraction process, and when they are present, a low-quality RNA is produced. Four RNA extraction methods (CTAB method, Hot Borate, CONCERT and Tri Reagent), in four different coffee tissues (root, leaf, flower and fruit) were tested in this work, aiming at determining which method is more efficient. It was observed that the CTAB and Hot Borate methods, in which PVP and/or β -mercaptoethanol were added and precipitation with LiCl was performed, presented more pure RNA, with no degradation observed in any of the tissues, being suitable for further gene expression analysis. High-quality RNA was not obtained from any tissue in the extraction with Tri Reagent, which includes the use of phenol, and thus expression analysis was disturbed. The CTAB macroextraction method presented samples with the highest RNA quality and largest quantities in all tissues. Future works need to be carried out aiming the standardization of this macroextraction method.
Embriogênese somática e validação do sistema CRISPR/CAS9 em Coffea canephora
(Universidade Federal de Lavras, 2020-05-11) Casarin, Tatiane; Diniz, Leandro Eugenio Cardamone; Paiva, Luciano Vilela
Coffea canephora é a segunda espécie mais cultivada do gênero Coffea, representando cerca de 25% da produção brasileira e sendo especialmente utilizada na indústria do café solúvel e em blends com Coffea arabica. A espécie apresenta alta variabilidade genética, tendo os programas de melhoramento buscado a identificação, seleção e propagação de genótipos com características superiores. Entretanto o melhoramento convencional demanda muito tempo e a aplicação de ferramentas biotecnológicas pode ajudar a acelerar este processo. Dessa forma, os objetivos deste trabalho foram testar diferentes protocolos de indução de embriogênese somática (ES) direta para C. canephora visando a sua aplicação em trabalhos futuros de transformação genética, a validação da aplicação de uma estratégia multiplex do sistema CRISPR/Cas9 através do silenciamento do gene CcPDS, e a obtenção de plantas com redução do teor de cafeína através do silenciamento, via CRISPR/Cas9, dos genes das enzimas de biossíntese da cafeína: xantosina metiltransferase (XMT), 7-metilxantina metiltransferase (MXMT) e 3,7-dimetilxantina metiltransferase (DXMT). Para a avaliação da indução de ES direta foram utilizados explantes provenientes de folhas de plântulas in vitro e de folhas de plantas de casa de vegetação de C. canephora clone 22, submetidos a três diferentes tratamentos de indução. O mais eficiente para indução de ES direta foi o Meio 3, com 96,25% de eficiência de indução e média de 34 embriões por explante de folhas in vitro e 67% de eficiência de indução e média de 67 embriões por explante de casa de vegetação. Em ambos experimentos de edição genômica, foram utilizados calos embriogênicos de C. canephora clone 14 e diferentes construções gênicas multiplex, nas quais os sgRNAs estavam sob a regulação de promotores U6 de C. canephora ou Arabidopisis thaliana. Plântulas e embriões apresentando os fenótipos albino, variegado e verde foram obtidas na transformação com as construções contendo sgRNAs para o gene CcPDS, sendo que 71,4% das plantas avaliadas apresentaram algum tipo de mutação, a maioria em homozigose. Seis plantas possivelmente transformadas para o silenciamento dos genes de síntese de cafeína foram analisadas e cinco estavam efetivamente transformadas. Destas, apenas uma apresentou mutações nas regiões reconhecidas pelos sgRNAs, sendo uma mutação em heterozigose no segundo alvo do gene XMT, uma mutação também em heterozigose nos dois alvos do gene DXMT e nenhuma mutação observada no gene MXMT. Com os resultados obtidos, é possível concluir que a ES direta é uma estratégia muito mais rápida de regeneração de embriões de cafeeiro e o genótipo parece ter forte influência no sucesso de estratégias de silenciamento gênico em C. canephora, assim como os genes a serem silenciados, que podem afetar o desenvolvimento das plantas editadas.
Identificação de fatores de transcrição MYB envolvidos em diversos processos celulares de Coffea arabica
(2007) Carneiro, Monalisa H.; Oliveira, Raphael Ricon de; Chalfun, Antonio; Paiva, Luciano Vilela; Embrapa - Café
O Brasil é o maior produtor mundial de café e é dono do segundo maior mercado consumidor. Uma das maiores preocupações dos produtores é a qualidade dos grãos que envolvem processos de florescimento e maturação influenciando na qualidade final do produto. Fatores de transcrição são genes reguladores-chave nos diversos processos biológicos que ocorrem durante o desenvolvimento do cafeeiro. Genes MYB constituem a mais extensa família de fatores de transcrição em plantas e dentre as diversas funções desempenhadas por proteínas MYB estão a regulação do ciclo celular, controle de numerosas rotas biossintéticas mais comumente incluindo produção de antocianinas, flavonóides; proliferação e especificação celular. Baseado no banco de dados CAFEST, identificou-se genes presentes nesta extensa família, sendo realizada análises de filogenia, análise dos motivos de agrupamento vizualisando as regiões conservadas e prováveis locais de expressão espacial e temporal ("Digital Northern Blot"). Desse modo foi possível a identificação de expressão de genes MYB envolvidos em vários processos celulares do cafeeiro.
Indução de embriões somáticos em diferentes clones de Coffea canephora
(Universidade Federal de Lavras, 2022-10-21) Silva, Paloma Carmelina da; Paiva, Luciano Vilela; Pinto, Renan Terassi
Com o advento da tecnologia CRISPR, a busca por novas técnicas eficientes de cultura de tecidos no cafeeiro tem se intensificado cada vez mais, visando principalmente o aperfeiçoamento de parâmetros relacionados às técnicas utilizadas atualmente, como a baixa eficiência dos eventos de edição e extenso período de tempo para a obtenção de plantas geneticamente editadas. Considerando que o Brasil ocupa a liderança na produção de café, sendo C. Canephora a segunda espécie mais cultivada, este trabalho teve como objetivo a determinação de protocolos eficientes de obtenção de embriões somáticos de C. canephora, utilizando embriogênese somática direta (ESD) e suspensão celular embriogênica de protoplastos, almejando aplicações em futuros trabalhos com edições genéticas via tecnologia CRISPR/Cas9. Para tal, foram realizados diferentes experimentos de indução ESD em C. canephora, inicialmente foram realizados testes para a verificação da influência de diferentes protocolos de ESD (para os clones 2 e 14), sendo também avaliado a influência das diferentes regiões das folhas ao serem inoculadas em meio para ESD (para clone 2), e posteriormente verificou-se a influência de diferentes clones no processo da ESD (para os clones 2, 14 e 22). Concomitantemente, buscou-se neste trabalho a indução de embriões somáticos de suspensão celular embriogênica de protoplastos (ECS) de C. canephora (Clone 14), para isso, utilizou-se meio de cultura Yasuda, enriquecido com carvão e variando agentes antioxidantes, carboidratos e concentrações de ácido abscísico (ABA). Os experimentos foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado e para as análises dos experimentos de ESD utilizou-se o teste de Tukey a 95% de confiança, já para os experimentos de indução de embriões em ECS, utilizou-se análise de regressão linear. No experimento de ESD foram avaliadas médias de frequência de regeneração e número médio de embriões por explante. Para o experimento de indução de embriões em suspensão celular embriogênica de protoplasto, foi avaliado o número médio de embriões obtidos em cada tratamento. Os resultados alcançados neste estudo, demonstraram que o clone 2 foi mais responsivo na embriogênese somática quando comparado aos clones 14 e 22, tanto em maiores frequências de regeneração de explantes, quanto em números de embriões por cada explante regenerado, indicando assim que a ESD é uma técnica altamente dependente do genótipo. Para o experimento da influência de diferentes regiões da folha na resposta embriogênica, não foi verificado diferenças entre as médias obtidas, assim como para diferentes protocolos utilizados. Tratando-se da indução de formação de embriões somáticos de ECS, foi observado a produção de embriões somente no meio de cultura enriquecido com 30 gL-1 sacarose e acrescido de ABA, não havendo diferença significativas entre diferentes concentrações de do regulador de crescimento na formação de embriões. Desta forma, conclui-se com este trabalho que é possível utilizar a ESD como forma de regeneração de embriões geneticamente editados, bem como a aplicação de protoplastos na edição do cafeeiro, embora ainda sejam necessários estudos mais aprofundados em relação ao aumento da frequência de regeneração e seu posterior amadurecimento.
Influência de reguladores de crescimento no desenvolvimento radicular de sementes de Coffea arabica L. 'Rubi' in vitro
(Editora UFLA, 2008-01) Lacerda, Guilherme Araújo; Chalfun-Júnior, Antonio; Paiva, Luciano Vilela; Melo, Emanuelle Ferreira; Oliveira, Anderson Castro Soares de; Rezende, Juliana Costa de
Avaliou-se o efeito de reguladores de crescimento na germinação e enraizamento in vitro de sementes de cafeeiro Rubi (Coffea arabica L. Rubi ). Sementes de plantas adultas de cafeeiro foram inoculadas em meio MS/2 + 20 g L-1 de sacarose e 6 g L-1 de ágar. Foram testados quatro tratamentos: T1 - controle; T2 - 6 mg L-1 de BAP + 0,1 mg L-1 de ANA; T3- 6 mg L-1 de BAP; T4 - 5 mg L-1 de GA3. O melhor tratamento obtido para enraizamento de sementes de cafeeiro foi o controle (MS/2 + ágar + sacarose), tornandose desnecessária a adição de reguladores de crescimento.
Inibição da tripsina de bicho-mineiro do cafeeiro por um fator não-protéico presente em extratos de folhas de mamona
(Editora UFLA, 2010-03) Rossi, Guilherme Duarte; Santos, Custódio Donizete dos; Cardoso, Maria das Graças; Corrêa, Angelita Duarte; Abreu, Celeste Maria Patto de; Paiva, Luciano Vilela
Inibidores de tripsina representam uma estratégia de controle de insetos e, por isso, a identificação e caracterização desses inibidores são etapas muito importantes para que novas formas de controle de pragas sejam desenvolvidas. Os inibidores de tripsina atuam na digestão primária de proteínas e comprometem o processo digestivo por completo, reduzindo a disponibilidade de aminoácidos ao inseto. A incorporação de inibidores de tripsina na dieta de insetos-praga é uma forma de controle cuja eficácia foi verificada por diferentes autores. Este projeto foi conduzido a fim de se observar a eficiência de extratos de folhas de mamona na inibição “in vitro” de proteinases do tipo tripsina do bicho-mineiro do cafeeiro. Após testes realizados com os extratos de folhas de mamona não-fervidos e fervidos com e sem a adição de -mercaptoetanol 0,2% (v/v) e mediante precipitações com acetona, verificou-se que o inibidor é uma molécula termoresistente e não-protéica. Desta forma, iniciou-se um processo de purificação da molécula inibidora por meio de cromatografia de adsorção com posterior análise em espectrômetro de massas. Os resultados dos testes de inibição indicaram a presença de um inibidor de tripsina eficaz contra o bicho-mineiro do cafeeiro nos extratos de folhas de mamona capaz de inibir 2,48 + 0,15 UTI, o que representa aproximadamente 40% de inibição. Em testes realizados com tripsina bovina observou-se que o extrato de folhas de mamona não apresenta poder de inibição sobre essa enzima.
Morphological characteristics and cell viability of coffee plants calli
(Universidade Federal de Santa Maria, 2014-04) Pádua, Marlúcia Souza; Paiva, Luciano Vilela; Silva, Luciano Coutinho da; Livramento, Kalynka Gabriella do; Alves, Eduardo; Castro, Ana Hortência Fonseca
The a im of this research was to characterize and compare two types of calli from leaf explants of Coffea arabica (cultivar Catiguá). Cells of different types of callus were successfully characterized regarding viability and internal and external morphological characteristics. It was obtained two morphologically distinct types of callus: (i) yellow friable and (ii) transparent watery. The yellow friable calli showed higher cell viability and embryogenic characteristics. Scanning and transmission electron microscopy showed embryogenic characteristics in cells of the yellow friable calli evidenced by the presence of small and isodiametric cells, while transparent watery calli showed elongated cells and large cytoplasm vacuolization.
Obtenção e caracterização de calos e plântulas a partir de embriões zigóticos imaturos de Coffea arabica L. e análise in silico do gene SERK
(Universidade Federal de Lavras, 2008-12-12) Lacerda, Guilherme Araújo; Paiva, Luciano Vilela
Pretendeu-se, com a realização deste trabalho, obterem-se alternativas, além do explante foliar e nodal, visando à micropropagação de cultivares de cafeeiros, relacionadas à qualidade da bebida, como o “Bourbon Amarelo’ e à produtividade, como o ‘Rubi’ para a região sul de Minas Gerais. Uma planta matriz de ‘Bourbon Amarelo’ foi utilizada para a obtenção dos frutos em estádio verde-cana de onde extraíram-se os embriões zigóticos imaturos. Observou-se que o maior percentual de crescimento pôde ser identificado aos 15 dias de cultivo dos embriões zigóticos imaturos em meio contendo o 99,91 μM de TDZ. O número médio de brotos na região da incisão no hipocótilo do embrião foi maior para o BAP (97,69 μM). Com o aumento da concentração de BAP, o número de folhas dos brotos aumenta proporcionalmente. Para a variável número de folhas isoladamente sob o efeito do BAP, em comparação a CIN e TDZ, observou-se efeito benéfico em decorrência do aumento de sua concentração. O efeito oxidativo do 2,4-D, causado pelas altas concentrações, chegou a 90% de probabilidade de oxidação e, possivelmente, estaria relacionado ao caráter herbicida do composto. O comportamento do TDZ e BAP, apesar de ambos apresentarem uma probabilidade menor para o crescimento do calo, revelou sua atuação no desenvolvimento do mesmo. Para o calo da cultivar Rubi, foi observado, ao MEV, que as células acumulam grande quantidade de grãos de amido, sugerindo que eles possam ser utilizados como marcadores iniciais do potencial embriogênico. A microscopia fotônica revelou que os calos provindos de embriões zigóticos apresentam-se como uma fonte de explante responsiva à embriogênese, mostrando indícios de formação de embriões somáticos em ‘Rubi’. Em relação à capacidade propagativa, não houve diferença significativa para a variável número de brotos entre o 6o e o 7o mês de cultivo, porém, houve um decréscimo no número de folhas e na matéria fresca e seca. Para os diâmetros polares e equatoriais, não houve diferenças significativas entre os cultivos in vitro e in vivo (de campo). Pôde ser observada diferença significativa (p<0,01) entre a relação diâmetro equatorial/polar, indicando maior simetria dos estômatos (células-guarda + ostíolo) na condição de cultivo in vitro. O número médio de estômatos por mm2 foi diferente, significativamente (p<0,01), entre os cultivos, sendo maior no material in vivo. O caule in vitro mostrou grande quantidade de tricomas, os quais, in vivo (de campo), não foram encontrados. O sistema radicular obtido in vitro apresenta estrutura pelífera. Devido à natureza juvenil e ao alto potencial regenerativo, verificado por meio das características da morfoanatomia foliar, embriões zigóticos de C. arabica L. cv. Rubi se apresentam como excelentes explantes para a propagação in vitro de cafeeiro. Na busca por prováveis genes dentro do banco de dados CAFEST em C. arábica, com base na similaridade com a seqüência de Coffea canephora para SERK, após o processo de busca e seleção de reads relacionados às seqüências, realizaram-se a montagem dos EST-contigs, o alinhamento entre seqüências e a análise filogenética. A análise de motifs de agrupamento pelo MEME/MAST revelou seqüências contendo domínios de aminoácidos relacionados a SERK. O perfil de expressão obtido pelo Northern Eletrônico revelou uma maior expressão das seqüências nas bibliotecas de calos e células em suspensão como se esperava, devido à competência celular esperada desses materiais. Tecidos que apresentam totipotência como fontes de explantes, como, por exemplo, hipocótilo, sementes, gemas florais, frutos e folhas, também foram visualizados contendo expressões desses genes candidatos. Dessa forma, foi possível identificar 12 seqüências prováveis (07 contigs e 05 singlets) relacionadas à SERK no banco de dados do CAFEST para Coffea arabica L., dos quais pelo menos C9 apresenta fortes indícios de similaridade com a proteína SERK de C. canephora.
Proteômica comparativa da interação genótipo, ambiente e processamento de grãos de café arábica
(Universidade Federal de Lavras, 2014-04-16) Livramento, Kalynka Gabriella do; Paiva, Luciano Vilela
Embora o cultivo do café arábica em alta altitude seja conhecido por afetar positivamente a qualidade final da bebida, os dados quantitativos que descrevem a influência das condições climáticas sobre a composição química dos grãos ainda são escassos. Da mesma forma, os tratamentos pós-colheita dos grãos são conhecidos por afetar a geração de sabor, mas as transformações químicas que ocorrem durante o processamento são mal compreendidas. Para melhor caracterizar os efeitos da altitude, processamento via seca e via úmida e suas possíveis interações, quantificamos as mudanças em um dos principais componentes químicos dos grãos, as proteínas. O presente trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar a composição protéica de grãos de Coffea arabica cultivares Bourbon amarelo e Acaiá, submetidos ao processamento via seca e via úmida e cultivados em duas diferentes faixas de altitudes, abaixo de 1000m e acima de 1200m. O método de avaliação utilizado foi a comparação do perfil proteômico, obtido por eletroforese bidimensional e os peptídeos gerados foram identificados por espectrometria de massa com ionização por eletrospray (ESI- MS/MS), com auxílio do programa MASCOT para a busca de homologia com proteínas descritas em diferentes bancos de dados. A diferença no perfil protéico provenientes dos grãos estudados pode fornecer subsídios para novas investigações dos processos bioquímicos e o papel das proteínas no metabolismo que envolve o sabor e aroma da bebida do café, permitindo integrar informações sobre o cultivo e tratamentos pós-colheita com a formação de compostos bioquímicos nas células.
Seleção de genes de referência e perfis de expressão gênica da família LAV durante a embriogênese somática em cafeeiro
(Universidade Federal de Lavras, 2015-02-26) Freitas, Natália Chagas; Paiva, Luciano Vilela
Visando contribuir para a compreensão do processo de indução da embriogênese somática, fundamental para o desenvolvimento de protocolos de regeneração mais eficientes, objetivou-se com esse trabalho identificar, caracterizar e analisar os padrões de expressão dos genes da família LAV durante a embriogênese somática indireta de Coffea arabica L. a partir da normalização de dados de RT- qPCR com genes de referência adequados. A correlação da expressão dos genes com o potencial embriogênico foi realizada comparativamente com o auxílio de análises histológicas e regeneração de embriões somáticos em duas linhagens independentes de suspensões celulares. Primeiramente, foi analisada a estabilidade de expressão de doze candidatos a genes de referência (24S, ACT, GAPDH, CYCL, EF1a, TUB, PP47, PP2A, RPL39, APRT, UBQ, 14-3-3) em diferentes tecidos e fases de desenvolvimento relacionados a embriogênese somática do cafeeiro. As análises foram realizadas através da ferramenta RefFinder que compila os algoritmos estatísticos geNorm, NormFinder, BestKeeper e Delta-Ct. Os resultados obtidos sugerem que não há um gene de referência universal adequado para todas as variáveis experimentais. A expressão mais estável em calo não embriogênico, calo embriogênico e suspensão celular em diferentes tempos de cultivo correspondeu aos genes UBQ, ACT e APRT, respectivamente. O gene RPL39 apresentou maior estabilidade na análise em conjunto de calos não embriogênicos e embriogênicos. Enquanto em plântula e embrião nos diferentes estádios, PP2A apresentou maior estabilidade de expressão. A análise em conjunto de todas as amostras indicou que 24S e PP2A são os genes de referência mais adequados para normalização de dados de RT-qPCR. Com o auxílio de ferramentas de bioinformática, foram identificados apenas três possíveis ortólogos de VAL2 (C15, SEA1 e SIC1) dentre os genes da família LAV. Os perfis de expressão verificados in vivo diferiram dos obtidos in silico, os dados mostraram expressão quantitativa relativa variável do C15 e SIC1 em todas as amostras analisadas e ausência de expressão de SEA1 em todos os tecidos. Não foi verificado relação dos níveis de expressão de C15 e SIC1 com o potencial embriogênico. As linhagens de suspensões celulares apresentaram o mesmo padrão histológico e aumento da taxa de regeneração em função do tempo de cultivo. O bom desenvolvimento das plântulas obtidas a partir do protocolo utilizado pode ser reflexo da alta expressão de VAL2 nos embriões cotiledonares. O conhecimento da expressão de VAL2 abre perspectiva para a melhoria do sistema de propagação via embriogênese somática, visando assegurar a conversão de embriões em plântulas normais.