SPCB - Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil
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Resultados da Pesquisa
Item Análise de híbridos interespecíficos em Coffea por citometria de fluxo(2003) Fontes, Bárbara Pereira Dantas; Carvalho, Carlos Roberto de; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféMétodos de análise do conteúdo de DNA por citometria de fluxo foram originalmente desenvolvidos para estudos em células humanas. Esta metodologia é baseada no uso de fluorocromos DNA-específicos e na análise da intensidade de fluorescência do núcleo corado. Em plantas, a introdução desta metodologia tem sido adaptada para as mais diversas análises, principalmente para avaliação de ploidia, quantificação do tamanho genômico, variações da quantidade de DNA intra e inter-específicas, apoptose, e correlações da quantidade de DNA com variações ambientais. Em estudos de melhoramento genético de plantas, a citometria de fluxo tem sido utilizada principalmente no monitoramento e identificação de híbridos. No presente estudo, amostras das espécies C. racemosa (2x), C. arabica (4x), dos supostos híbridos interespecíficos UFV 557 e das plantas H920, resultantes do retrocruzamento entre C. arabica e UFV 557.3, tiveram seus conteúdos de DNA estimados por citometria de fluxo. Folhas jovens e vigorosas das plantas foram previamente lavadas, acondicionadas em recipiente contendo água destilada e mantidas a 4°C. Após a assepsia, fragmentos de 2 cm 2 foram cortados, com auxílio de uma lâmina de barbear, em 1 mL de solução tampão de lise. A suspensão foi filtrada em uma tela de 30 µm de diâmetro, e transferida para tubos de Eppendorf. Após centrifugação, o sobrenadante foi removido e a camada de núcleos ressuspendida em tampão. A suspensão nuclear foi corada com solução 15 µM de 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), por 10 a 15 minutos, no escuro, e analisada por um citômetro de fluxo equipado com três parâmetros e lâmpada HBO, de arco de mercúrio 100 W, para excitação em UV. Amostragens com coeficientes de variação acima de 3.06% foram desconsideradas. Os valores de DNA estimados para as plantas UFV 557.1; UFV 557.2; UFV 557.3; UFV 557.4; UFV 557.6 foram de 1.95 a 1.97 pg, intermediários aos valores de C. racemosa (2x=1.11 pg) e C. arabica (4x= 2.77 pg), confirmando o caráter triplóide das plantas UFV 557. Os híbridos obtidos entre C. arabica e UFV 557.3 apresentaram valores de 2.75 a 2.79 pg, próximos ao valor do tetraplóide. Os resultados obtidos confirmaram que a citometria de fluxo é uma metodologia importante no monitoramento e identificação de híbridos de Coffea em programas de melhoramento.Item Análise citogenética de Coffea canephora(2001) Fontes, Bárbara Pereira Dantas; Carvalho, Carlos Roberto de; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféCom o objetivo de obter cromossomos de C. canephora (2n=2x=22) morfologicamente adequados para serem caracterizados citogeneticamente e identificados para montagem do cariograma desta espécie, empregaram-se novas técnicas citogenéticas associadas às metodologias computacionais de análise de imagens. Sementes foram germinadas em placas de Petri a 28oC, em estufa. Raízes com aproximadamente 0,5 cm foram pré-tratadas com brometo de etídeo a 10 µM com 100 µl de DMSO, por 24h a 5oC. Fixaram-se as pontas de raízes excisadas em solução de metanol: ácido acético (3:1), armazenando-as -20oC. Após 24 horas, as pontas de raízes foram digeridas enzimaticamente com solução de Flaxzyme diluída em água destilada (1:60) por 10 minutos à temperatura ambiente. Prepararam-se as lâminas por dissociação celular do meristema, simultâneamente com gotejamento da solução fixadora, sendo elas, em seguida, secadas ao ar. A coloração foi obtida com solução de Giemsa a 2% em tampão fosfato pH 6,8. As metodologias empregadas permitiram a obtenção de cromossomos com alta qualidade citogenética e resolução adequada para caracterização de cada par de homólogos, aparentemente semelhantes, quando obtidos por meio de técnicas convencionais. A caracterização da morfologia desses cromossomos resultou em dados que diferiram daqueles relatados na literatura.Item Estudo dos cromossomos de Coffea arabica por métodos de análise de imagem(2000) Fontes, Bárbara Pereira Dantas; Carvalho, Carlos Roberto de; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféO Coffea arabica, apesar da grande importância econômica, tem sido pouco estudado citogeneticamente. O pequeno tamanho de seus cromossomos tem dificultado análises morfológicas mais detalhadas. No presente estudo, foram utilizadas técnicas citogenéticas com dissociação celular e secagem ao ar para obtenção de cromossomos morfologicamente mais preservados. Metodologias computacionais foram realizadas para obter medições mais precisas, ampliações de imagens cromossômicas, além da montagem do cariograma desta espécie. Sementes de C. arabica foram germinadas em placas de Petri à 28o C, no escuro. Meristemas radiculares foram pré-tratados com solução de Trifluralin a 3mM com 100ml de DMSO, por 18h à 5o C. A fixação foi realizada com solução de metanol ácido acético (3:1) com três trocas. Após 24 horas, as raízes foram digeridas enzimaticamente com Flaxzyme diluída em água destilada (1:10). As lâminas foram preparadas por dissociação do meristema, gotejamento e técnica de secagem ao ar. A coloração foi realizada pela metodologia convencional de Giemsa à 2% em tampão fosfato de pH 6,8. As técnicas permitiram a identificação de cada par de homólogos, possibilitando a obtenção do cariograma do C. arabica, com cromossomos bem definidos, além de proporcionarem a observação de diferenças e similaridades quanto a morfologia.