Teses e Dissertações
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Item Caracterização de uma região genômica do híbrido de timor CIFC 832/2 associada à resistência à Hemileia vastatrix(Universidade Federal de Viçosa, 2019-07-31) Alves, Danúbia Rodrigues; Caixeta, Eveline Teixeira; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Almeida, Dênia Pires deA ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix é a principal doença de importância econômica dessa cultura, sendo responsável por grandes prejuízos à cafeicultura mundial. Novas raças do patógeno têm surgido infectando cultivares de café comercializados como resistentes a essa doença. Desse modo, devido ao alto potencial adaptativo do fungo, a busca por cafeeiros resistentes a essa doença é uma atividade recorrente nos programas de melhoramento. Estudos com o Híbrido de Timor (HdT), tem sido realizados em pesquisas que visam resistência durável à ferrugem e outras doenças do cafeeiro. Compreender a natureza da resistência duradoura em genótipos do HdT e descrever os genes envolvidos na defesa das plantas é fundamental para o uso eficiente dos recursos disponíveis nesse híbrido natural. A utilização de ferramentas moleculares e de bioinformática tem mostrado resultados significativos para a ampliação do conhecimento dos genes envolvidos no patossistema Coffea - H. vastatrix. Desse modo, objetivou-se com esse estudo sequenciar e caracterizar, por meio de análises de bioinformática, uma região do genoma do Híbrido de Timor CIFC 832/2, que contém marcadores associados à resistência à H. vastatrix. Para isso foi realizado o sequenciamento do clone BAC 70-22F contendo a marca funcional de resistência, por meio da Plataforma Illumina MiSeq (paired – end reads). Posteriormente foi feita a montagem dos contigs e a predição dos genes. Realizou-se a anotação gênica com base nos genomas de Coffea arabica, Coffea canephora e Coffea eugenioides, utilizando a ferramenta BLAST. A anotação gênica revelou a presença de genes candidatos relacionados ao mecanismo de resistência de hospedeiros contra patógenos. Foram anotados 991 genes do clone BAC 70-22F. Desses genes, 340 foram anotados com similaridade com o genoma de C. arabica (var. Caturra), 337 com o genoma de C. eugenioides e 314 com o genoma de C. canephora (clone IF 200). Com base na anotação gênica foram selecionadas duas sequências de genes candidatos a receptores like kinases (RLK) e desenhados primers para estudo do perfil de expressão gênica durante a interação Coffea - H. vastatrix. Um possível gene de resistência, LRR receptor-like serine/threonine-protein kinase GSO2, foi descrito e apresentou um perfil de expressão correspondente a uma resposta de resistência pré-haustorial. O outro possível receptor like kinase em estudo, apresentando um domínio LRR, exibiu uma diminuição na expressão gênica pré-haustorial em genótipos incompatíveis. As análises filogenéticas desses genes, bem como os estudos de identidade e similaridade genética da região genômica clonada, demonstraram uma relação mais próxima entre o clone BAC 70-22F e a espécie C. arabica e corroboram com a diversidade genética descrita para o HdT. Os resultados sugerem que a região genômica clonada do HdT CIFC 832/2 possui importantes genes candidatos a resistência do cafeeiro à H. vastatrix e apresentam informações relevantes para ampliar o conhecimento sobre o HdT, podendo contribuir para futuros planejamentos de estratégias de melhoramento do cafeeiro.Item Identificação de análogos a genes de resistência (RGAs) a Hemileia vastatrix no genoma Coffea arabica e avaliação da expressão gênica na interação(Universidade Federal de Viçosa, 2022-05-25) Estanislau, Giovana Gomes; Caixeta, Eveline TeixeiraDas mais de 100 espécies de café, Coffea arabica e Coffea canephora são as de maior interesse comercial. As pragas e doenças que incidem sobre os cafeeiros são responsáveis pela redução da qualidade e produtividade da cultura, além de elevarem os custos de produção e os riscos ambientais advindos da aplicação de agrotóxicos. Um exemplo é a doença causada pelo fungo Hemileia vastatrix. Alternativas de controle das doenças do cafeeiro têm sido desenvolvidas, com destaque à obtenção e uso de cultivares resistentes. Sendo assim, os estudos do genoma e genética funcional de plantas e interações com patógenos aumentaram consideravelmente a compreensão acerca das bases moleculares associadas com o processo de infecção e defesa das plantas. Essas tecnologias têm fornecido oportunidade para selecionar novos alvos a serem incorporados nas novas cultivares com o objetivo de obter resistência duradoura. Um alvo candidato importante a ser explorado são os genes PRRs (Pattern Recognition Receptor) e R (Plant resistance genes), chamados de análogos de genes de resistência (Resistance Gene Analog -RGAs) que compartilham domínios e motivos conservados. Sendo assim, o objetivo desse estudo foi identificar e classificar análogos a genes de resistência (RGAs) no genoma de C. arabica e analisar sua expressão em transcriptoma da interação Coffea-Hemileia vastatrix. Para isso, uma abordagem baseada em predição de domínios funcionais em proteínas codificadas pelos RGAs foi empregada, fazendo uso de duas ferramentas, sendo elas, o RRGPredictor e o DRAGO2.Foram identificadas dezenove classes gênicas e vinte e cinco genes candidatos com potencial envolvidos na resistência de C. arabica a H.vastatrix. No transcriptoma da interação Coffea-H. vastatrix foi observada uma possível atuação dos genes identificados na resistência pré-haustorial do cafeeiro. A identificação desses genes permitirá entender melhor como funciona a interação entre Coffea e Hemileia vastatrix, além de contribuírem para a seleção assistida de cultivares cafeeiras resistentes nos programas de melhoramento. Palavras-chave: Bioinformática. Ferrugem no cafeeiro. Análogos de genes a resistência.Item Análises bioinformáticas de proteínas de resistência do tipo nucleotide binding site-leucine rich repeat (NBS-LRR) de café(Universidade Federal de São Carlos, 2019-02-02) Morazán, Andrés Santiago Ortiz; Silva, Flávio HenriqueOs fatores moleculares envolvidos na resistência a ferrugem do café e outras doenças ainda não são totalmente conhecidos, mas os projetos relacionados com o tema vêm sendo feitos desde o século passado. Um dos principais problemas que dificultam a identificação destes fatores é a falta de uma versão estável do genoma do Coffea arabica. Recentemente, o consórcio World Coffee Research (WCR) liberou a sua versão do genoma de C. arabica feito com tecnologia de Sequenciamento de Nova Geração (NGS). É conhecido que as relações patogênicas da Ferrugem e o Café têm proteínas efetoras que interagem com proteínas do tipo NBS-LRR da planta. Estas ativam a resposta imunitária da planta, o que resulta normalmente em Reações de Hipersensibilidade (HR). O gene de resistência de café S H 3 codifica uma proteína similar à classe Coiled Coil-NBS-LRR e, sabe-se que as plantas que contêm esse gene apresentam resistência vertical à ferrugem. A procura de fatores similares ao gene S H 3 poderia prover novos fatores de resistência que possam ser utilizados no desenvolvimento de novas variedades de café com resistência vertical para ferrugem. Neste estudo, foi possível identificar de proteínas presentes exclusivamente em genomas de plantas do gênero Coffea, assim como motivos presente exclusivamente em sequências de café arábico e robusta. Também foi possível identificar a localização cromossômica das sequencias identificadas. Finalmente, os resultados deste estudo conseguiram classificar e fazer anotações de todas as proteínas candidatas com o objetivo de utiliza-las em programas de melhoramento genético de café.Item Seleção de genes de referência e perfis de expressão gênica da família LAV durante a embriogênese somática em cafeeiro(Universidade Federal de Lavras, 2015-02-26) Freitas, Natália Chagas; Paiva, Luciano VilelaVisando contribuir para a compreensão do processo de indução da embriogênese somática, fundamental para o desenvolvimento de protocolos de regeneração mais eficientes, objetivou-se com esse trabalho identificar, caracterizar e analisar os padrões de expressão dos genes da família LAV durante a embriogênese somática indireta de Coffea arabica L. a partir da normalização de dados de RT- qPCR com genes de referência adequados. A correlação da expressão dos genes com o potencial embriogênico foi realizada comparativamente com o auxílio de análises histológicas e regeneração de embriões somáticos em duas linhagens independentes de suspensões celulares. Primeiramente, foi analisada a estabilidade de expressão de doze candidatos a genes de referência (24S, ACT, GAPDH, CYCL, EF1a, TUB, PP47, PP2A, RPL39, APRT, UBQ, 14-3-3) em diferentes tecidos e fases de desenvolvimento relacionados a embriogênese somática do cafeeiro. As análises foram realizadas através da ferramenta RefFinder que compila os algoritmos estatísticos geNorm, NormFinder, BestKeeper e Delta-Ct. Os resultados obtidos sugerem que não há um gene de referência universal adequado para todas as variáveis experimentais. A expressão mais estável em calo não embriogênico, calo embriogênico e suspensão celular em diferentes tempos de cultivo correspondeu aos genes UBQ, ACT e APRT, respectivamente. O gene RPL39 apresentou maior estabilidade na análise em conjunto de calos não embriogênicos e embriogênicos. Enquanto em plântula e embrião nos diferentes estádios, PP2A apresentou maior estabilidade de expressão. A análise em conjunto de todas as amostras indicou que 24S e PP2A são os genes de referência mais adequados para normalização de dados de RT-qPCR. Com o auxílio de ferramentas de bioinformática, foram identificados apenas três possíveis ortólogos de VAL2 (C15, SEA1 e SIC1) dentre os genes da família LAV. Os perfis de expressão verificados in vivo diferiram dos obtidos in silico, os dados mostraram expressão quantitativa relativa variável do C15 e SIC1 em todas as amostras analisadas e ausência de expressão de SEA1 em todos os tecidos. Não foi verificado relação dos níveis de expressão de C15 e SIC1 com o potencial embriogênico. As linhagens de suspensões celulares apresentaram o mesmo padrão histológico e aumento da taxa de regeneração em função do tempo de cultivo. O bom desenvolvimento das plântulas obtidas a partir do protocolo utilizado pode ser reflexo da alta expressão de VAL2 nos embriões cotiledonares. O conhecimento da expressão de VAL2 abre perspectiva para a melhoria do sistema de propagação via embriogênese somática, visando assegurar a conversão de embriões em plântulas normais.Item Identificação e caracterização parcial de genes SEPALLATA em café arábica(Universidade Federal de Lavras, 2009-07-01) Paula, Márcia Fabiana Barbosa de; Chalfun Júnior, AntonioO café é um dos mais importantes commodity internacionais, produzido em mais de sessenta países e classificado entre as cinco exportações agrícolas mais valorizadas de países em desenvolvimento. Uma das maiores dificuldades dessa cultura consiste na heterogeneidade do florescimento, consequentemente, desuniformidade na maturação dos frutos, o que dificulta a colheita e prejudica a qualidade dos grãos. Tendo em vista a importância econômica do café e a dificuldade apresentada, este trabalho surgiu a partir da necessidade de um melhor entendimento dos fatores genéticos que compõe essa rota, já que o processo de florescimento depende da expressão equilibrada de uma rede complexa de genes. Os genes SEPALLATA (SEP) fazem parte dessa rota e são responsáveis pela determinação dos quatro verticilos florais, indicando com a ajuda de outros genes a identidade do meristema floral. Desta forma, esse trabalho teve como objetivo estudar os genes SEP em Coffea arabica. Primeiramente foram realizadas análises in silico para identificar esses genes no genoma café, por meio do banco de dados CAFEST. Três prováveis genes SEP, foram identificados e submetidos a análises de motivos, domínios, agrupados em árvores filogenéticas e análise da expressão por Northern eletrônico. Essas sequências apresentaram os domínios característicos da família gênica, agrupando com genes SEP de outras espécies, e como esperado, a expressão foi observada em bibliotecas de flores e frutos em desenvolvimento. Os experimentos para caracterização parcial foram realizados no Laboratório de Biologia Molecular da Universidade Federal de Lavras, UFLA, onde, após serem desenhados primers específicos, essas amplicons foram submetidas à clonagem, sequenciamento e comparação com genes SEP obtidas na análise in silico. Por meio de comparação, somente duas sequências foram consideradas similares e caracterizadas como possíveis genes SEP1/2 e SEP3. Além disso, foi realizada a análise de expressão por PCR em tempo real, onde também foram observadas as expressões dos fragmentos em tecidos de flores e frutos. Com todas essas análises foi possível a identificação e caracterização parcial de pelo menos dois genes SEP em café, porém, se faz necessário, a partir dos resultados obtidos, de trabalhos de expressão in situ e estudos de mutantes para uma melhor caracterização desses genes.Item Análise dos genes homólogos de florescimento em café arábica(Universidade Federal de Lavras, 2011-02-23) Barreto, Horllys Gomes; Chalfun Júnior, AntonioApesar dos vários estudos que abordaram a fisiologia e os processos de desenvolvimento do café, muitos aspectos diretamente relacionados com a qualidade do café ainda requerem uma melhor compreensão, como o processo de regulação do florescimento. A maturação desuniforme dos frutos do cafeeiro, gerada pelo florescimento sequencial encontrado nessa espécie, afeta diretamente a sua produtividade e leva a aumentos nos custos de produção e também a uma bebida de menor qualidade. Assim, objetivando uma melhor compreensão do processo de florescimento do café (Coffea arabica), realizou-se neste trabalho a identificação e caracterização dos genes FLOWERING LOCUS C, FRIGIDA, REDUCED VERNALIZATION RESPONSE 2 e VERNALIZATION INSENSITIVE 3 em café. Análises in silico realizadas no banco de ESTs (Expressed Sequence Tags) CAFEST permitiram a identificação dos genes estudados, os quais tiveram suas sequências confirmadas. As análises de expressão realizadas pela técnica da PCR quantitativa em tempo-real (qPCR) mostraram que os quatro genes foram expressos em todos os tecidos analisados (raízes, folhas de plantas submetidas ao estresse hídrico, folhas, e flores) e sugeriram que todos estejam envolvidos na regulação do florescimento em café. Estudos futuros que envolvam mutantes para esses genes em plantas- modelo e em café possibilitarão um melhor entendimento das funções desempenhadas por cada um desses genes no florescimento, assim como uma melhor compreensão desse processo como um todo.Item Análise molecular e fisiológica do etileno durante o amadurecimento de frutos de café(Universidade Federal de Lavras, 2012-09-11) Ságio, Solange Aparecida; Chalfun Júnior, AntonioA qualidade do café está diretamente associada ao estádios de maturação dos frutos na época da colheita, o qual é frequentemente desuniforme devido ao florescimento sequencial presente no café, elevando o custo de produção e gerando bebida de baixa qualidade. Alguns estudos sugerem que o café seja um fruto climatérico indicando que o etileno apresenta um importante papel no processo de maturação do café. As cultivares precoces geralmente apresentam um processo de maturação mais uniforme, no entanto pouco se sabe sobre os fatores genéticos que promovem a precocidade da maturação. Assim, com o objetivo de melhor entender os fatores fisiológicos e genéticos envolvidos na regulação do tempo de maturação, os perfis da produção de etileno e da respiração durante a maturação de frutos de cultivares precoce (Catucaí 785-15) e tardia (Acauã) foram analisados. Assim como os perfis da expressão de elementos das rotas de biossíntese e sinalização do etileno. As análises de respiração e de etileno mostraram diferentes comportamentos entre as duas cultivares de café. Os frutos da Catucaí 785-15 apresentaram uma típica elevação climatérica na respiração e na produção de etileno durante a maturação, enquanto que os frutos da Acauã apresentaram somente pequenas mudanças nesses parâmetros. As análises in silico permitiram a identificação de prováveis membros de quase todos os passos das rotas de biossíntese e sinalização do etileno. As análises de RT-qPCR demonstraram que os genes da biossíntese (CaACS1-like; CaACO1-like; CaACO4-like e CaACO5) analisados nesse estudo, foram induzidos nos estádios finais da maturação em ambas cultivares, com destaque para CaACS1-like e CaACO4-like que apresentaram maiores níveis de expressão do que aqueles encontrados em folhas e flores, indicando que estes genes possam apresentar um importante papel na maturação do café. Por outro lado, os membros da rota de sinalização do etileno apresentaram um padrão distinto daquele encontrado para os genes da biossíntese, com todos os genes, de ambas cultivares, apresentando níveis de expressão um pouco maiores nos estádios iniciais de desenvolvimento. As análises de expressão dos genes da biossíntese CaACO1-like e CaACO4-like e do receptor de etileno CaETR4-like, sugerem que os maiores níveis de produção de etileno nos frutos da Catucaí 785- 15 possam induzir uma maior degradação do CaETR4-like, levando a um aumento na sensibilidade ao etileno e consequentemente à precocidade no processo de maturação desta cultivar. A produção de etileno nos frutos da Acauã pode não ser suficiente para desativar os níveis de CaETR4-like e assim as mudanças na maturação ocorrem em um ritmo mais lento, sugerindo que esta cultivar apresente um fenótipo climatérico suprimido.Item Obtenção e caracterização de calos e plântulas a partir de embriões zigóticos imaturos de Coffea arabica L. e análise in silico do gene SERK(Universidade Federal de Lavras, 2008-12-12) Lacerda, Guilherme Araújo; Paiva, Luciano VilelaPretendeu-se, com a realização deste trabalho, obterem-se alternativas, além do explante foliar e nodal, visando à micropropagação de cultivares de cafeeiros, relacionadas à qualidade da bebida, como o “Bourbon Amarelo’ e à produtividade, como o ‘Rubi’ para a região sul de Minas Gerais. Uma planta matriz de ‘Bourbon Amarelo’ foi utilizada para a obtenção dos frutos em estádio verde-cana de onde extraíram-se os embriões zigóticos imaturos. Observou-se que o maior percentual de crescimento pôde ser identificado aos 15 dias de cultivo dos embriões zigóticos imaturos em meio contendo o 99,91 μM de TDZ. O número médio de brotos na região da incisão no hipocótilo do embrião foi maior para o BAP (97,69 μM). Com o aumento da concentração de BAP, o número de folhas dos brotos aumenta proporcionalmente. Para a variável número de folhas isoladamente sob o efeito do BAP, em comparação a CIN e TDZ, observou-se efeito benéfico em decorrência do aumento de sua concentração. O efeito oxidativo do 2,4-D, causado pelas altas concentrações, chegou a 90% de probabilidade de oxidação e, possivelmente, estaria relacionado ao caráter herbicida do composto. O comportamento do TDZ e BAP, apesar de ambos apresentarem uma probabilidade menor para o crescimento do calo, revelou sua atuação no desenvolvimento do mesmo. Para o calo da cultivar Rubi, foi observado, ao MEV, que as células acumulam grande quantidade de grãos de amido, sugerindo que eles possam ser utilizados como marcadores iniciais do potencial embriogênico. A microscopia fotônica revelou que os calos provindos de embriões zigóticos apresentam-se como uma fonte de explante responsiva à embriogênese, mostrando indícios de formação de embriões somáticos em ‘Rubi’. Em relação à capacidade propagativa, não houve diferença significativa para a variável número de brotos entre o 6o e o 7o mês de cultivo, porém, houve um decréscimo no número de folhas e na matéria fresca e seca. Para os diâmetros polares e equatoriais, não houve diferenças significativas entre os cultivos in vitro e in vivo (de campo). Pôde ser observada diferença significativa (p<0,01) entre a relação diâmetro equatorial/polar, indicando maior simetria dos estômatos (células-guarda + ostíolo) na condição de cultivo in vitro. O número médio de estômatos por mm2 foi diferente, significativamente (p<0,01), entre os cultivos, sendo maior no material in vivo. O caule in vitro mostrou grande quantidade de tricomas, os quais, in vivo (de campo), não foram encontrados. O sistema radicular obtido in vitro apresenta estrutura pelífera. Devido à natureza juvenil e ao alto potencial regenerativo, verificado por meio das características da morfoanatomia foliar, embriões zigóticos de C. arabica L. cv. Rubi se apresentam como excelentes explantes para a propagação in vitro de cafeeiro. Na busca por prováveis genes dentro do banco de dados CAFEST em C. arábica, com base na similaridade com a seqüência de Coffea canephora para SERK, após o processo de busca e seleção de reads relacionados às seqüências, realizaram-se a montagem dos EST-contigs, o alinhamento entre seqüências e a análise filogenética. A análise de motifs de agrupamento pelo MEME/MAST revelou seqüências contendo domínios de aminoácidos relacionados a SERK. O perfil de expressão obtido pelo Northern Eletrônico revelou uma maior expressão das seqüências nas bibliotecas de calos e células em suspensão como se esperava, devido à competência celular esperada desses materiais. Tecidos que apresentam totipotência como fontes de explantes, como, por exemplo, hipocótilo, sementes, gemas florais, frutos e folhas, também foram visualizados contendo expressões desses genes candidatos. Dessa forma, foi possível identificar 12 seqüências prováveis (07 contigs e 05 singlets) relacionadas à SERK no banco de dados do CAFEST para Coffea arabica L., dos quais pelo menos C9 apresenta fortes indícios de similaridade com a proteína SERK de C. canephora.Item Caracterização in silico e análise da expressão de genes das rotas de biossíntese e sinalização do etileno em frutos de diferentes cultivares de café (coffea arabica)(Universidade Federal de Lavras, 2011-07-28) Lima, André Almeida; Chalfun Júnior, AntonioO café é a segunda mercadoria mais comercializada no mundo se colocando como uma importante fonte de renda e de empregos em vários países, principalmente nos países em desenvolvimento, como o Brasil, o maior produtor e segundo maior consumidor mundial de café. A qualidade do café, dentre outros fatores, está diretamente associada ao estádio de maturação dos frutos na época da colheita, o qual frequentemente apresenta uma grande desuniformidade devido ao florescimento sequencial do cafeeiro. Alguns trabalhos sugerem que o café constitua um fruto climatérico indicando que o etileno apresenta um importante papel na sua maturação. As cultivares precoces de café geralmente apresentam uma maior uniformidade na maturação de seus frutos, no entanto, pouco se sabe sobre os fatores genéticos que regulam esta característica de precocidade da maturação. Assim, este trabalho teve como objetivos realizar a caracterização in silico de prováveis genes das rotas de biossíntese e sinalização do etileno e analisar a expressão de alguns destes genes durante a maturação de frutos de uma cultivar tardia (Acauã) e precoce (Catucaí 785-15). As sequências selecionadas a partir das buscas realizadas no banco de dados CAFEST tiveram sua similaridade analisada por árvores filogenéticas sendo que seus perfis de expressão in silico foram analisados por Northerns eletrônicos. Os frutos do cafeeiro foram coletados no período de março a junho de 2008 e 2009 em intervalos de 30 dias e as análises de expressão gênica foram feitas por qRT- PCR. O banco de dados CAFEST apresentou um grande número de sequências relacionadas aos genes envolvidos na biossíntese e sinalização do etileno, permitindo a identificação de prováveis membros destas rotas em quase todos seus pontos. As árvores filogenéticas demonstraram a alta similaridade entre as sequências encontradas no CAFEST e aquelas de outras espécies, e os Northerns eletrônicos detectaram suas expressões em diferentes tecidos, estádios de desenvolvimento e condições de estresse. As análises de expressão para os prováveis genes que codificam para ACO (CaACO3) e para o receptor de etileno (CaETR4) mostraram que esses genes são diferencialmente regulados durante a maturação, com elevações de seus níveis nas coletas com maior porcentagem de frutos nas colorações vermelho-claro e cereja em ambas cultivares. O provável fator de transcrição ERF (CaERF4) parece apresentar elevados níveis de expressão durante todas as coletas não sendo diferencialmente expresso durante a maturação nas cultivares em estudo.