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Associação de Xylella fastidiosa com espécies e híbridos interespecíficos de cafeeiro
(2000) Yorinori, Marcos Akio; Ribas, Alessandra Ferreira; Leite, Rui Pereira; Funada, Caio Katsumi; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
A bactéria Xylella fastidiosa possui uma ampla gama de plantas hospedeiras que inclui espécies de pelo menos 28 famílias de mono e dicotiledôneas. No cafeeiro, a ocorrência dessa bactéria foi relatada em cultivares da espécie Coffea arabica. Estudos foram realizados para determinar a presença de X. fastidiosa em diferentes espécies e híbridos interespecíficos de cafeeiro (Coffea spp.). As espécies de Coffea examinadas foram: C. kapakata, C. canephora, C. racemosa, C. arabica, C. dewevrei, C. stenophylla e C. eugenioides. Os híbridos examinados foram: C. arabica x C. dewevrei, C. arabica x C. eugenioides, C. arabica x C. racemosa e C. arabica x C. robusta. Foram coletadas quatro amostras de ramos plagiotrópicos de plantas diferentes para cada espécie e híbrido, tendo sido utilizadas quatro repetições. A detecção de X. fastidiosa nas amostras foi realizada pelo teste serológico de DAS-ELISA. A bactéria foi detectada nas sete espécies e nos quatro híbridos examinados. Entretanto, as plantas examinadas aparentemente não apresentavam sintomas de alteração no seu desenvolvimento.
Determinação do crescimento potencial de frutos e folhas de café
(2007) Hastenreiter, Fábio A.; Faria, Rogerio Teixeira de; Ribas, Alessandra Ferreira; Chibana, Eduardo Yasuji; Gomes, Carolina Dias; Embrapa - Café
Modelos de crescimento de culturas são importantes ferramentas na previsão de safras, no entendimento dos processos biológicos e para fins didáticos. No entanto, para seu funcionamento correto, há necessidade de incluir os principais fatores envolvidos no crescimento e desenvolvimento das plantas, além de parametrizar corretamente as equações que compõem o modelo matemático. Dentre os parâmetros, é necessário determinar o crescimento potencial de frutos e folhas do café durante a frutificação. Nesse trabalho, a determinação do crescimento potencial foi realizada em um experimento no qual a concorrência por fotoassimilados foi diminuída pelo raleio de frutos e folhas e sua disponibilidade foi aumentada pelo anelamento dos ramos produtivos . Foram realizadas avaliações periódicas do crescimento das folhas, medindo-se o maior comprimento e largura, e dos frutos, medindo-se o maior diâmetro longitudinal (comprimento) (C) e menor diâmetro transversal central (largura) (L-). Os resultados indicaram área foliar máxima de 53cm2 e crescimento máximo de frutos de 15,1mm em comprimento e 11,8mm em largura.
Estimativa da massa e volume de frutos de café usando métodos não destrutivos
(2007) Hastenreiter, Fábio A.; Faria, Rogerio Teixeira de; Meireles, Elza Jacqueline Leite; Chibana, Eduardo Yasuji; Ribas, Alessandra Ferreira; Gomes, Carolina Dias; Embrapa - Café
A avaliação do crescimento dos frutos do café é, normalmente, feita por coleta do fruto, inviabilizando a avaliação continua do mesmo fruto durante toda sua maturação. O objetivo deste trabalho foi estabelecer métodos não destrutivos, baseados em modelos de regressão, para estimar massas seca e fresca e volume de frutos de café a partir de medidas dos comprimentos longitudinal e transversal do fruto. O estudo foi conduzido em cafezal da cultivar IAPAR 59, sem irrigação, instalado na Estação Experimental do IAPAR em Londrina, PR. Foram tomadas as medidas de maior diâmetro longitudinal (comprimento), maior e menor diâmetro transversal (largura), volume, massa fresca e massa seca de frutos em diferentes estádios de desenvolvimento, e analisadas as correlações entre elas. Concluiu-se que as massas fresca e seca e o volume dos frutos podem ser estimados de forma eficiente e não destrutiva a partir de medidas de comprimento e largura.
Identificação e caracterização de genes de ACC oxidase de café
(2001) Galvão, Rafaelo Marques; Kobayashi, Adilson Kenji; Ribas, Alessandra Ferreira; Bespalhok, João Carlos; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
O fitorregulador etileno está associado a vários eventos fisiológicos em plantas. Em frutos climatéricos, um aumento dramático na síntese de etileno promove os passos subseqüentes do amadurecimento. A enzima ACC oxidase catalisa o último passo de biossíntese deste fitorregulador, convertendo 1-aminociclopropano-1- ácido carboxílico (ACC) em etileno. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar genes de ACC oxidase de Coffea spp. para serem usados subseqüentemente em projetos de transformação genética visando o controle da maturação dos frutos. Oligonucleotídeos baseados em regiões conservadas de genes heterólogos de ACC oxidase foram projetados para amplificar o fragmento a partir de cDNA. Fragmentos de cDNA amplificados foram clonados no vetor pUC 18 através do SureClone TM Ligation Kit (Amershan Pharmacia Biotech). Um clone completo de 0,96 Kb de C. arabica foi obtido. A sequência de nucleotídeos e de aminoácidos demonstrou alta homologia com ACC oxidase de Actinidia , Carica, Prunus e Betula. Para determinar o padrão de expressão do gene em diferentes tecidos e de frutos em diferentes estádios de maturação foi usada a técnica de RT-PCR. Houve diferentes níveis de expressão de ACC oxidase nos tecidos testados. Como esperado, a expressão de ACC oxidase foi elevada em frutos de café em fases iniciais de amadurecimento. O gene de ACC oxidase foi clonado em orientação anti-senso em vetores para transformação direta e em vetores binários, contendo promotor e terminador 35S CaMV.
Presença de Xylella fastidiosa em sementes e mudas de cafeeiro
(2000) Yorinori, Marcos Akio; Ribas, Alessandra Ferreira; Funada, Caio Katsumi; Jr., Nelson Sidnei Massola; Leite, Rui Pereira; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
A ocorrência de Xylella fastidiosa em cafeeiro (Coffea arabica) tem sido reportado em diversos estudos. O presente trabalho teve por objetivo determinar a presença de X. fastidiosa em sementes e mudas de cafeeiro, bem como a possibilidade de transmissão da bactéria via semente. Foram examinados 12 lotes de sementes de cafeeiro das cultivares IAPAR 59, Catuaí Amarelo, Catuaí Vermelho, Mundo Novo, Acaiá, Sarchimor Amarelo, Icatu Precoce, Apoatã e IAPAR 75 163-21. O lote 102/C/98 da cultivar IAPAR 59, foi utilizado para produção de mudas visando estudar a transmissão da bactéria via semente. Os testes foram realizados em diferentes estádios de desenvolvimento das plântulas, como palito-de-fósforo, orelha-de-onça, e mudas com 2, 4, 5 e 6 pares de folhas. Também foram examinadas plântulas produzidas em viveiro nesses diferentes estádios de desenvolvimento. Para detectar a bactéria nas amostras foi utilizado o teste serológico de DAS-ELISA. A presença de X. fastidiosa foi constatada em oito lotes de sementes das cultivares IAPAR 59, Catuaí Vermelho, Mundo Novo, Acaiá e Sarchimor Amarelo. Nas mudas produzidas a partir de lote de sementes naturalmente infectadas não foi detectada a presença da bactéria X. fastidiosa em todos os estádios de desenvolvimento examinados. Para as mudas de viveiro, plântulas com 3, 4 e 6 pares de folhas apresentaram resultado positivo para presença de X. fastidiosa. Este resultado indica que a infecção de cafeeiro por X. fastidiosa pode ocorrer logo nos primeiros estádios de desenvolvimento das plantas.
Produção de plantas transgênicas de café resistentes ao herbicida glufosinato de amônio
(2005) Ribas, Alessandra Ferreira; Kobayashi, Adilson Kenji; Pereira, Luiz Felipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Embrapa - Café
Plantas transgênicas de Coffea canephora P. resistentes ao herbicida glufosinato de amônio foram regeneradas a partir de explantes foliares co-cultivados com Agrobacterium tumefaciens EHA105 contendo o plasmídio pCAMBIA3301, que contém os genes bar e uidA ambos sob controle do promotor 35S ou pIBI3 (3300 contendo o gene da ACC oxidase, antisenso) ou ainda bombardeados com o plasmídio pCAMBIA3301. Embriogênese somática direta foi induzida no meio contendo ¼ dos macros e metade dos micronutrientes do meio MS, constituintes orgânicos do meio B5 e 30 g.L-1 de sacarose, suplementado com 5mM N6 - (2-isopentenil)adenina (2-iP) e 10 mM de glufosinato de amônio para seleção de embriões transgênicos putativos. A presença e a integração do gene bar foram confirmados pelas análises de PCR e Southern blot. As plantas transgênicas pulverizadas com 1600 mg.L-1 do herbicida Finale que contém glufosinato como ingrediente ativo, não apresentaram sintomas de toxidez, mantiveram a coloração e continuaram crescendo normalmente na aclimatação ex vitro.
Production of herbicide-resistant coffee plants (Coffea canephora P.) via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation
(Instituto de Tecnologia do Paraná - Tecpar, 2006-01) Ribas, Alessandra Ferreira; Kobayashi, Adilson Kenji; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves
Transgenic plants of Coffea canephora P. resistant to the herbicide ammonium glufosinate were regenerated from leaf explants after co-culture with Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 harboring pCambia3301, a plasmid that contains the bar and the uidA genes both under control of 35S promoter. Direct somatic embryogenesis was induced on basal medium contained 1⁄4 strength macro salts and half strength micro salts of MS medium, organic constituents of B 5 medium and 30 g.L -1 sucrose supplemented with 5 μ M N 6 – (2-isopentenyl)-adenine (2-iP). Ten μ M ammonium glufosinate was used for putative transgenic somatic embryos selection. Presence and integration of the bar gene were confirmed by PCR and Southern blot analysis. Selected transgenic coffee plants sprayed with up to 1600 mg.L -1 of Finale  , a herbicide containing glufosinate as the active ingredient, retained their pigmentation and continued to grow normally during ex vitro acclimation.
Thidiazuron como indutor de embriogênese somática em café (Coffea canephora Pierre)
(2000) Kobayashi, Adilson Kenji; Pereira, Luiz Felipe Protasio; Bespalhok, Carlos; Ribas, Alessandra Ferreira; Galvão, Rafaelo Marques; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
Os efeitos de thidiazuron (TDZ) na indução de embriogênese somática em Coffea canephora foi investigado. Explantes foliares de C. canephora foram cultivados em um meio de cultura suplementado com diferentes concentrações de TDZ. Embriões somáticos foram observados nas concentrações de 0,25 até 2 mM, após dois meses em cultivo. Dentre os tratamentos testados, TDZ a 1 mM mostrou a mais alta freqüência de explantes com regeneração e maior número de embriões por explante. Entretanto, a indução de embriogênese somática ocorreu de forma não-sincronizada com todos os tratamentos investigados apresentando embriões em diferentes estádios de desenvolvimento.
Transformação de café mediada por Agrobacterium tumefaciens
(2001) Ribas, Alessandra Ferreira; Kobayashi, Adilson Kenji; Bespalhok, João Carlos; Galvão, Rafaelo Marques; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
O objetivo deste trabalho foi estabelecer protocolos de transformação genética mediada por Agrobacterium tumefaciens para as espécies C. canephora e C. arabica, usando o herbicida glufosinato de amônio como agente seletivo. Explantes de C. canephora foram cultivados em meio para indução de embriogênese direta, suplementados com 5 mM de 2-iP por três semanas. Para C. arabica, tecidos embriogênicos foram induzidos em meio WPM suplementado com 1,7 mM de BA e 0,7 mM de GA3. Os explantes e os tecidos embriogênicos foram imersos em suspensão de Agrobacterium tumefaciens EHA105 contendo o plasmídeo pCambia3301, que contém genes de b-glucuronidase (gus) e fosfinotricina acetiltransferase (bar), que confere resistência ao glufosinato de amônio, ou pIBI3, que contém o genes bar e ACC-oxidase de melão na orientação anti-senso. Os explantes foram submetidos à sonicação por 2 segundos e transferidos para meio ED no escuro e co-cultivados por quatro dias a 24oC. Após esse período, foram transferidos para meio ED fresco contendo 10 mM de glufosinato e 400 mg.L -1 de cefotaxima. Tecidos embriogênicos de C. canephora e C. arabica resistentes ao glufosinato de amônio foram submetidos à análise histoquímica do gene gus. A atividade do gene gus foi detectada em 82,2% dos tecidos de C. canephora testados e nos calos recém-formados de C. arabica resistentes ao glufosinato de amônio. A integração do gene bar foi confirmada em tecidos embriogênicos de C. canephora pela análise de PCR.
Transformação de Coffea canephora P. com gene para resistência à herbicida através de bombardeamento de partículas
(2001) Ribas, Alessandra Ferreira; Kobayashi, Adilson Kenji; Bespalhok, João Carlos; Galvão, Rafaelo Marques; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo de transformação de Coffea canephora P. através de bombardeamento de partículas, usando o herbicida glufosinato de amônio como agente seletivo. Explantes foliares de C. canephora foram usados para indução de embriogênese somática. Inicialmente, explantes foram cultivados em meio ED suplementado com 5 mM de 2iP por 40 dias. Explantes com embriões somáticos foram então transferidos para meio contendo a metade da concentração dos macro e micronutrientes dos sais de MS suplementado com 9 mM de 2,4 D. Após duas semanas, explantes com embriões somáticos e tecido embriogênico foram bombardeados com partículas de tungstênio (M-25) cobertas com o plasmídio pCambia 3301 (contendo os genes bar e gus), usando um sistema de aceleração de partículas com alta pressão de hélio (PDS 1000/He - BioRad). As condições usadas para o bombardeamento foram: 1.300 psi de pressão; 60 ou 90 mm de distância percorrida pelas partículas; e pré e pós-cultivo dos explantes em meio com alta osmolaridade. Os explantes bombardeados foram submetidos a seleção em meio ED contendo 5 mM de glufosinato de amônio. Após seis meses, embriões transgênicos putativos foram transferidos para meio ED sem reguladores de crescimento para germinação. A análise histoquímica do gene gus nessas plântulas foi positiva, enquanto nenhuma atividade foi observada em plantas controle. A integração do gene bar foi confirmada pela análise de PCR.
Transformação genética de Coffea canephora mediada por Agrobacterium tumefaciens com gene heterólogo de ACC-oxidase na orientação anti-senso
(2003) Ribas, Alessandra Ferreira; Kobayashi, Adilson Kenji; Cação, Sandra Maria Bellodi; Pereira, Luiz Felipe Protasio; Ayub, Ricardo Antônio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
O fitorregulador etileno está associado a vários eventos fisiológicos em plantas. Em frutos climatéricos, um aumento dramático na síntese de etileno promove os passos subseqüentes do amadurecimento. Uma das alternativas para obtenção de plantas com maturação uniforme é o controle da síntese do fitorregulador etileno, pode ser feito através da transformação genética de plantas com genes da sua rota metabólica em orientação anti-senso. A enzima ACC oxidase, que catabolisa o último passo da biossíntese deste fitoregulador, tem sido um dos alvos preferidos para inibição com genes anti-senso, com uma conseqüente redução na produção de etileno. O objetivo deste trabalho foi introduzir o gene da ACC-oxidase do melão em plantas de C. canephora P. via Agrobacterium tumefaciens, usando o herbicida glufosinato de amônio como agente seletivo. Explantes de C. canephora foram cultivados em meio para indução de embriogênese direta ED (1/4 macro e 1/ 2 dos micronutrientes do meio MS, vitaminas do meio B 5 , 30 g.L -1 de sacarose, 100 mg.L -1 de cisteína), suplementados com 5 mM de 2-iP por três semanas. Os explantes foram imersos em suspensão de Agrobacterium tumefaciens EHA105 contendo o plasmídio pIBI3 que contém os genes da fosfinotricina acetiltransferase (bar) e da ACC-oxidase do melão na orientação anti-senso. Os explantes foram submetidos à sonicação por 2 segundos, sendo em seguida transferidos para meio ED e co-cultivados por 4 dias a 24° C no escuro. Após este período, os explantes foram transferidos para meio ED fresco contendo 10 mM de glufosinato e 400 mg.L -1 de cefotaxima. Inicialmente, 87 explantes foram co-cultivados e produziram 18 calos embriogênicos resistentes ao glufosinato quatro meses após a infecção. Embriões transgênicos putativos foram transferidos para meio ED sem fitoreguladores para permitir germinação. As plântulas provenientes de cinco eventos independentes foram aclimatadas em casa-de-vegetação. A análise de PCR confirmou a presença de fragmentos amplificados do gene bar (516 pb) em 44 das 62 plantas analisadas. Em plantas controle (não transformadas) nenhuma amplificação foi observada. A análise de Southern blot foi conduzida para avaliar a integração do gene da ACC oxidase de melão em plantas de C. canephora P. Os resultados demonstraram a presença do transgene em todas as seis plantas analisadas. A dupla digestão com as enzimas de restrição EcoR I e Hind III, liberou um fragmento de aproximadamente 1200 pb que hibridizou com a sonda correspondente ao transgene. Plantas transformadas e plantas controle foram pulverizadas com 1% (v/v) de uma formulação comercial de herbicida (Finale, AgrEvo â ) contendo 20% de glufosinato de amônio. Plantas controle demonstraram os primeiros sintomas de intoxicação 48 h após a pulverização devido a acumulação de amônia nos tecidos, e uma semana após as plantas estavam totalmente necrosadas. Nas plantas transformadas nenhum sintoma foi observado. As plantas estão em fase de crescimento em casa-de-vegetação. A determinação da produção de etileno será realizada, através de cromatografia gasosa, quando as plantas iniciarem a frutificação.