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ANÁLISE DE EXPRESSÃO E POLIMORFISMO NUCLÉICOS DE GENES CANDIDATOS PARA A TOLERÂNCIA À SECA EM CAFEEIRO
(2011) Freire, Luciana Pereira; Vieira, Natália Gomes; Vinecky, Felipe; Alves, Gabriel Sérgio Costa; Heimbeck, Ingrid Gomes Renoldi; Rodrigues, Gustavo Costa; Marraccini, Pierre; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
O presente trabalho teve como objetivos (i) analisar a expressão de genes candidatos (GC), que foram previamente identificados em plantas de Coffea canephora,e agora analisar a expressão em plantas de Coffea arabica cultivadas no campo e submetidas e não submetidas ao estresse hídrico e (ii) avaliar a diversidade genética de alguns GCs por meio da busca dos polimorfismos nucléicos. Os experimentos de expressão gênica foram realizados com os cultivares IAPAR59 (tolerantes à seca) e Rubi (sensível à seca) de C. arabica cultivados com e sem irrigação durante a estação seca. As folhas foram amostradas no ano de 2008 foram utilizadas para analisar a expressão de GCs por PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Em paralelo, seqüências gênicas correspondentes aos GC foram clonadas e seqüenciadas a partir do DNA genômico de diferentes espécies, clones e cultivares de cafeeiro. Os polimorfismos foram identificados e permitiram de definir os haplótipos encontrados nos genótipos estudados.
Análise in silico das bibliotecas de cDNA SH2 e SH3 para a identificação de genes responsivos à seca em cafeeiro
(Editora UFLA, 2012-01) Vinecky, Felipe; Silva, Felipe Rodrigues da; Andrade, Alan Carvalho
O Brasil é o maior produtor e exportador de café no mundo e a cafeicultura é uma fonte de renda importante, para pequenos produtores. A seca, que vem se tornando cada vez mais intensa ao longo dos anos, prejudica a produção desses agricultores. Para auxiliar o desenvolvimento de plantas tolerantes à seca, vários grupos de pesquisa buscam uma melhor compreensão dos fatores genéticos envolvidos na resposta das plantas à seca. A construção e sequenciamento de bibliotecas ESTs (Expressed Sequence Tags) é um meio rápido e efetivo de se obter informações acerca da maioria dos genes expressos. O genoma funcional, do cafeeiro realizado por meio do sequenciamento de cDNAs (ESTs), possibilitou a construção de um amplo banco de dados de ESTs com sequências de três espécies distintas de Coffea. A base de dados do genoma café constitui uma rica fonte de informações para estudos genéticos e fisiológicos do cafeeiro. Objetivou-se, no presente trabalho identificar genes candidatos (GC), potencialmente envolvidos na resposta ao estresse hídrico em cafeeiro, a partir de uma análise in silico dos ESTs disponíveis na base de dados do genoma café. Para essas análises foram utilizadas comparações in silico entre os dados de ESTs das bibliotecas SH2 (Coffea arabica) e SH3 (Coffea canephora), com o auxílio das ferramentas de bioinformática disponíveis na base de dados do genoma café. Com a metodologia utilizada, vários GC foram identificados e podem ser objeto de estudos experimentais posteriores, visando a seleção assistida por marcadores moleculares e para a rápida obtenção de variedades de café tolerantes à seca.
Análise in silico de genes potencialmente envolvidos na resposta aos estresses abióticos, presentes na base de dados do genoma café
(2005) Vinecky, Felipe; Brito, Kelly Martins de; Silva, Felipe R. da; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
Os danos potenciais dos estresses abióticos tais como seca, salinidade e temperaturas extremas na produção agrícola mundial é alarmante, tendo em vista as constantes alterações climáticas observadas nas últimas décadas ao redor do globo. Desta forma, a ampliação do conhecimento científico acerca dos fatores genéticos envolvidos na tolerância dos vegetais a esses estresses, com vistas ao melhoramento genético destas características, é prioritário. Foi concluído recentemente, com o apoio do Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café (CBP&D-Café), o projeto Genoma Café. Este projeto consistiu no seqüenciamento em larga escala de genes expressos (ESTs) de café e teve como meta, identificar e anotar de 20 a 30.000 genes de Coffea spp. a partir do seqüenciamento de 200.000 clones de ESTs obtidos de diversas bibliotecas de cDNA, inclusive aquelas oriundas de material vegetal submetido a estresses abióticos. Com a conclusão do projeto, está disponível para pesquisa um banco de dados contendo uma parcela significativa dos genes expressos em café (transcriptoma), associados às diversas condições de estresse submetidas ou tecidos utilizados para a construção das bibliotecas. O objetivo do presente trabalho, foi realizar uma análise prospectiva dos fatores genéticos potencialmente associados à resposta aos estresses abióticos, presentes na Base de Dados do Genoma Café. Essa análise baseou-se na identificação de genes de café com alta similaridade aos previamente descritos, caracterizados como genes envolvidos na resposta aos estresses abióticos (EREA), em outras espécies vegetais. Através das análises de tBlastn, genes de café com alto nível de similaridade (e-value [=ou<] 10-20) aos 355 genes EREA pesquisados, foram identificados, em mais de 91% dos casos. Apenas 5% dos genes EREA pesquisados, não resultaram em genes análogos de café, com nível significativo de similaridade (e-value [=ou<] 10-5). A observação de que a maioria desses genes não encontrados na base de dados do café, são genes relacionados às respostas ao frio, pode ser justificada pela ausência de ESTs provenientes de bibliotecas de cDNA, com esse tipo de estresse. Por outro lado, essas diferenças poderiam estar relacionadas às diferenças fisiológicas marcantes entre arabidopsis e cafeeiro, com relação à tolerância ao frio, uma vez que grande parte dos genes EREA utilizados nesta pesquisa, são provenientes de arabidopsis. Pode-se concluir com os resultados obtidos, que a utilização da Base de Dados do Genoma Café é uma ferramenta poderosa na rápida identificação e seleção de potenciais genes de interesse agronômico de café, para a realização de ensaios experimentais de caracterização funcional.
ANÁLISES DA EXPRESSÃO GÊNICA POR PCR QUANTITATIVO EM TEMPO REAL (QPCR) DE GENES CANDIDATOS PARA A TOLERÂNCIA À SECA EM CAFEEIRO
(2011) Vinecky, Felipe; Alves, Gabriel Sérgio Costa; Vieira, Natália Gomes; Freitas, Luciana Pereira; Heimbeck, Ingrid Gomes Renoldi; Ferrão, Romário Gava; Fonseca, Aymbiré Francisco Almeida da; Ferrão, Maria Amélia Gava; Silva, Vânia Aparecida; Marraccini, Pierre; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
A seca é uma das principais limitações climáticas à produção do cafeeiro. A importância dessa limitação deve aumentar, em função das mudanças reconhecidas no clima global e, também, porque a cafeicultura vem sendo expandida para regiões marginais onde a baixa pluviosidade e temperaturas desfavoráveis se constituem grandes limitações à produção do café. A seca induz diversas respostas fisiológicas e moleculares nas plantas, incluindo alterações da expressão gênica, visando atingir ajuste osmótico, a indução de reparadores de sistemas moleculares e a expressão de diversas proteínas protetoras. Existem diversas formas de se avaliar a expressão gênica em plantas submetidas ao estresse hídrico. Uma técnica amplamente utilizada nos últimos anos, para a análise quantitativa da expressão gênica é a de PCR quantitativo em tempo real (qPCR). O objetivo do presente trabalho foi analisar a expressão de 14 genes candidatos para a tolerância à seca em cafeeiro, pré-selecionados em estudos de macroarranjos de cDNA, utilizando clones de Coffea canephora (Clone 22 – sensível e clones 14, 73 e 120 – tolerantes ao estresse hídrico).
CARACTERIZAÇÃO DA REGIÃO PROMOTORA DO GENE DREB2A DE GENÓTIPOS DE COFFEA CANEPHORA CONTRASTANTES PARA A TOLERÂNCIA À SECA
(2011) Alves, Gabriel Sérgio Costa; Freitas, Luciana Pereira; Heimbeck, Ingrid Gomes Renoldi; Vieira, Natália Gomes; Vinecky, Felipe; Marraccini, Pierre; Paiva, Luciano Vilela; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
Apesar de alguns estudos em fisiologia vegetal resultarem em uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na tolerância à seca em cafeeiro, ainda é escasso o conhecimento acerca das alterações metabólicas e moleculares envolvidos na resposta do cafeeiro às condições de estresse hídrico. Neste sentido, resultados prévios obtidos, analisando-se a expressão relativa do gene DREB2A dos clones 14 (tolerante a seca) e 22 (sensível a seca) de Coffea canephora var. Conilon, demonstraram expressão diferencial desse gene em folhas de plantas submetidas ou não ao estresse hídrico. Polimorfismos na região promotora do gene DREB2A foram identificados e podem indicar a participação de diferentes haplótipos no controle genético da tolerância a seca. O objetivo deste trabalho consiste na engenharia de cassetes gênicos utilizando o vetor binário pBI121 combinado com diferentes segmentos da região promotora do gene DREB2A, isolados dos clones 14 e 22 de C. canephora com o intuito de permitir uma melhor caracterização in vivo, da participação dos elementos cis e da influência dos polimorfismos observados na funcionalidade deste promotor em relação às respostas do cafeeiro ao estresse hídrico.
Construção de macroarranjos de cDNA de café, para a identificação de genes de interesse agronômico
(2007) Vinecky, Felipe; Vieira, Natália G.; Ferreira, Daniela L.A.; Freire, Luciana P.; Marraccini, Pierre Roger Rene; Silva, Felipe R. da; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
Para a construção dos macroarranjos, foi gerado inicialmente um conjunto não redundante de clones (Unigene), resultante da análise do banco de dados gerado no projeto Genoma Café. Utilizando-se um sistema automatizado para o rearranjo (Q-Bot), um conjunto não redundante com aproximadamente 33 mil clones foi rearranjado, perfazendo um total de 86 placas de 384 poços. O DNA plasmidial de todo esse conjunto de clones (33 mil), foi extraído e amostras representativas de cada uma das placas foi analisada por eletroforese em gel de agarose. Com o objetivo de se ter uma idéia do resultado do rearranjo, 4 clones aleatórios (1 clone/ quadrante de 96) de cada placa de 384 foram seqüenciados e comparados por análises de BlastN na Base de Dados do Genoma Café, para a confirmação da identidade dos clones. Do total de seqüências analisado, verificou-se uma porcentagem de 8% de erros ocorridos no rearranjo. Essas placas foram rearranjadas e amostras, novamente seqüenciadas. Após essa etapa, as membranas serão construídas e o presente trabalho teve como objetivo, avaliar a metodologia para a construção de macroarranjos, em escala piloto, para se determinar as melhores condições para a impressão de DNA nas membranas do Unigene Café. Foram avaliados os parâmetros, tipo de DNA a ser impresso (DNA plasmidial vs. Produto de PCR) e a concentração a ser utilizada. De modo geral, a impressão das membranas utilizando-se o equipamento Q-Bot (Genetix) foi bastante uniforme entre as repetições, apresentando muito baixa variação e como esperado, os sinais radioativos apresentados pelos produtos de PCR, foram superiores aos de plasmídeo, devido à razão molar diferente e provável melhor desnaturação devido ao fato de serem fragmentos de DNA lineares.
DESENVOLVIMENTO DE NOVAS METODOLOGIAS PARA A IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS DURANTE O DESENVOLVIMENTO DE FRUTOS DO CAFÉ (COFFEA ARABICA L.)
(2011) Heimbeck, Ingrid Gomes Renoldi; Taquita, Jorge Alex; Prates, Maura Vianna; Vinecky, Felipe; Alves, Gabriel Sérgio Costa; Vieira, Natália Gomes; Freire, Luciana Pereira; Bloch Junior, Carlos; Marraccini, Pierre; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
O café é uma das bebidas mais consumidas e um dos principais produtos agrícolas,comercializado mundialmente. A espécie Coffea arabica, preferível pelos agricultores, fornece grãos cuja bebida é reconhecida como de melhor qualidade pois constituí-se bioquimicamente de elevadas concentrações de carboidratos, lipídeos e trigonelina. O desenvolvimento e crescimento do fruto são caracterizados pela evolução dos tecidos embrionários e alterações bioquímicas, ilustrando a importância do seu estudo para melhor compreender as características finais dos grãos. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma nova metodologia eficaz na identifcação do conteúdo protéico expresso no endosperma do fruto do café da espécie C. arabica var. IAPAR59 (I59) em diferentes estágios de maturação. A metodologia utilizada neste trabalho baseia-se na estratégia proteômica bottom-up, com digestão protéica, análises por cromatografia líquida em fase reversa e espectrometria de massa com interfaces on-line e off-line. O primeiro permitiu o assinalamento da estrutura primária completa de vinte e sete peptídeos que foram identificados por alinhamento semântico local (BLAST) e apresentaram homologia com quatro proteínas com função ainda desconhecida e nove proteínas com funções já descritas, dentre elas a globulina 11S e a dehydrina, envolvida na proteção osmótica das células vegetais. A interface on-line permitiu o assinalamento da estrutura primária de trinta e quatro peptídeos, dos quais treze deles correspondiam a proteínas com funções ainda desconhecidas, quatro com sequências ainda não descritas e quatorze proteínas com funções conhecidas expressas nos diferentes estágios de desenvolvimento. Diante do exposto, as técnicas utilizadas neste trabalho abrem boas perspectivas para uma melhor compreenção das alterações proteômicas que ocorrem durante os diferentes estágios de desenvolvimento e maturação dos grãos cafeeiros. Entretanto, ajustes metodológicos ainda se fazem necessários para permitir a identificação de um número maior de proteínas, especialmente aquelas em menor abundância.
DESENVOLVIMENTO DE UMA METODOLOGIA PARA A IDENTIFICAÇÃO DE METABÓLITOS DURANTE O DESENVOLVIMENTO DO FRUTOS DE CAFÉ
(2011) Heimbeck, Ingrid Gomes Renoldi; Prates, Maura Vianna; Taquita, Jorge Alex; Vinecky, Felipe; Alves, Gabriel Sergio Costa; Vieira, Luciana Pereira; Bloch Junior, Carlos; Marraccini, Pierre; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
O gênero Coffea pertence à família Rubiaceae e compreende aproximadamente 100 espécies. A maioria do café comercialmente disponível consiste de grãos produzidos pelas espécies C. arabica e C. canephora. O sabor e o aroma da bebida de café são altamente complexos, resultantes da presença combinada de vários constituintes químicos voláteis e não voláteis, que compõem os aromas e sabores. A bebida possui também muitos compostos fenólicos que são metabólitos secundários das plantas e estão envolvidos na adaptação aos estresses. Eles conferem ao café potentes efeitos biológicos, incluindo atividades antioxidantes, antimutagenicas, anticarcinogenicas, antibioticas, antihipertensivas, antihipercolesterolemicas e antiinflamatorias. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma metodologia eficaz para identificar um desses compostos fenólicos, a arbutina, no pericarpo e o endosperma dos grãos de café de Coffea arabica var. IAPAR59 (I59). Assim, diferentes estágios de maturação desses dois tecidos foram testados usando a técnica de cromatografia líquida de alta eficência (UFLC). Para cada amostra, foi feita uma corrida com o extrato bruto e outra com o extrato contendo o padrão comercial (arbutina). Os resultados mostram que a arbutina não foi detectada nas amostras analisadas. Entretanto, esse composto fenólico pode estar associado ou complexado com outras moléculas, o que alteraria o perfil de eluição desta molécula, quando comparado ao padrão. Estudos posteriores em outros estágios fenólogicos do fruto assim como outros tecidos da planta ainda deverão serfeitos para se avaliar esta hipótese.
Determinação dos teores de ácido abscísico, durante a fase de maturação de sementes de Coffea arabica e Coffea canephora
(2005) Silva, Edvaldo A. A. da; Braga, Elvis A.; Brito, Kelly Martins de; Vinecky, Felipe; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
O ácido abscísico (ABA) é um hormônio natural envolvido na regulação da expressão gênica em importantes processos fisiológicos vegetais. Durante o crescimento vegetativo das plantas, o ABA atua nas respostas a vários fatores de estresses ambientais tais como seca e condições de alta salinidade. O ácido abscísico também desempenha importante função fisiológica, durante o processo de formação de sementes, sendo necessário para desencadear a síntese de lipídeos e proteínas de reserva, na ocorrência de dormência e na aquisição de tolerância à desidratação e ao frio. Desta forma, a caracterização da expressão gênica sob a regulação do ácido abscísico, durante a maturação de sementes de espécies vegetais, pode proporcionar importantes ferramentas para aplicação na biotecnologia e engenharia genética. Entretanto, muito pouco é sabido sobre as bases genéticas e os determinantes moleculares destes aspectos, em sementes do cafeeiro. Assim, o objetivo desde trabalho foi o de determinar os teores de ABA durante a fase de maturação de sementes de Coffea arabica e Coffea canephora, assim como, identificar e caracterizar os genes regulados por esse hormônio. Amostras das sementes de Coffea arabica cv. Rubi e C. canephora cv. Apoatã IAC foram coletadas dos 120 até 270 d.a.f. (dias após a floração), em intervalos de 30 dias. Os embriões foram isolados, congelados em nitrogênio líquido e posteriormente liofilizados e macerados. Parte das amostras foi utilizada para a quantificação de ABA e a outra parte, para a extração de RNA. A análise da expressão foi realizada em membranas, contendo DNA de 96 genes, previamente selecionados na Base de Dados do Genoma Café. A seleção dos genes foi baseada em estudos anteriores, realizados com Arabidopsis, indicando o efeito do ABA na regulação de genes similares. Os resultados indicam um acúmulo máximo de ABA, por volta de 180 d.a.f. para C. arábica e 210 d.a.f. para C. canephora. Resultados preliminares da expressão gênica, indicam que a variação no teor de ABA, durante a fase de maturação de sementes de café, tem efeito direto na expressão de vários dos genes analizados.
EFEITO DE DIFERENTES NÍVEIS DE ADUBAÇÃO SOBRE A COMPOSIÇÃO BIOQUÍMICA EM GRÃO DE COFFEA ARABICA CV. RUBI
(2011) Vinecky, Felipe; Davrieux, Fabrice; Alves, Gabriel Sérgio Costa; Heimbeck, Ingrid Gomes Renoldi; Mera, Ana Carolina; Leroy, Thierry; Bonnot, François; Pot, David; Rocha, Omar Cruz; Guerra, Antonio Fernando; Rodrigues, Gustavo Costa; Marraccini, Pierre; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
As condições edafoclimáticas podem afetar a qualidade do café . No caso de cafeeiros (C. arabica L.), a adubação adequada resulta no aumento da produção e também pode afetar a composição bioquímica final do grão e na qualidade da bebida. Por uma grande parte, essa qualidade depende dos compostos acumulados no café verde que podem também servir como padrões para avaliar a qualidade. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos de diferentes níveis de adubação NPK sobre a composição bioquímica dos grãos de café. Os níveis de certos compostos (cafeína, lipídios, sacarose, trigonelina e ácidos clorogênicos) em grãos de café produzidos a partir de plantas cultivadas sob diferentes níveis de adubação, e durante três anos de colheita consecutivos (2007 até 2009), foram avaliados por espectroscopia de infravermelho próximo (NIRS).
EXPRESSÃO DO GENE RBCS1 EM CAFÉ: COFFEA ORTÓLOGOS, COFFEA ARABICA HOMEÓLOGOS E VARIABILIDADE DE EXPRESSÃO ENTRE GENOTIPOS E SOB ESTRESSE HIDRICO
(2011) Vieira, Natália Gomes; Freire, Luciana Gomes; Alves, Gabriel Sérgio Costa; Vinecky, Felipe; Elbelt, Sonia; Ramos, Humberto Josué de Oliveira; Montagnon, Christophe; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Leroy, Thierry; Pot, David; Silva, Vânia Aparecida; Rodrigues, Gustavo Costa; Marraccini, Pierre; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
A expressão do gene RBCS1 foi analisada no contexto da alopoliploidia de C. arabica. O nosso estudo revelou a existência de dois genes RBCS1 homeólogos em C. arabica: um oriundo do sub-genoma de C. canephora (chamado CaCc) e o outro oriundo do sub-genoma de C. eugenioides (chamado CaCe). Usando primers específicos de cada homeólogos, os estudos da expressão revelaram que CaCe se expressava em C. eugenioides e C. arabica mas nao em C. canephora. Por outro lado, CaCc se expressava em C. canephora mas estava quase silenciado em genótipos não- introgredidos (“puros”) de C. arabica. Entretanto, uma expressão de CaCc foi observada na maioria dos cultivares de C. arabica introgredidos com genoma de C. canephora. Para ambas as espécies, o estresse hídrico levou a uma diminuição importante na abundância dos transcritos RBCS1. Isto foi observado para as plantas cultivadas na casa de vegetação ou no campo sob um estresse severo ou moderado.
IDENTIFICAÇÃO DE GENES COM EXPRESSÃO DIFERENCIAL EM FOLHAS DE CAFEEIRO Coffea canephora E Coffea arabica SUBMETIDAS À DIFERENTES CONDIÇÕES DE ESTRESSE HÍDRICO
(2009) Marraccini, Pierre; Alves, Gabriel Sergio Costa; Vinecky, Felipe; Freire, Luciana Pereira; Vieira, Natalia Gomes; Ramos, Humberto J. O.; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Elbelt, Sonia; Marques, Thomas; Rodrigues, Gustavo Costa; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
Com a perspectiva de se estabelecer um programa de melhoramento genético por seleção assistida para a tolerância à seca em cafeeiro, o presente trabalho objetivou a identificação de genes candidatos para esta característica, por meio de análises integradas dos perfis de expressão gênica e protéico. Os resultados foram obtidos a partir de análises comparativas da expressão gênica e protéica de diferentes materiais genéticos (Tolerante vs. Sensível) assim como, diferentes regimes hídricos (Controle vs. Estresse hídrico). Os materiais genéticos estudados neste trabalho foram os clones de conillon 22 e 14 (Coffea canephora) e os cultivares Rubi e Iapar 59 (Coffea arabica). O estresse hídrico (Ψ PD =-3,0 MPa) aplicado às plantas de conillon foi obtido em casa de vegetação e no caso de Arabica, foram avaliadas plantas adultas em condições de campo, sendo as folhas colhidas nos períodos diurno e noturno, onde o maior estresse hídrico observado foi de Ψ PD =-1,7 MPa. Após a seleção dos genes candidatos por meio de diferentes estratégias, a expressão diferencial foi validada por qPCR. Os resultados mostram que muitos genes apresentaram uma queda de expressão com o estresse hídrico e esses genes, em geral, codificam proteínas implicadas na fotossíntese. Por outro lado, o estresse hídrico em cafeeiro, também induz a expressão de vários genes já descritos na literatura como essênciais à resposta das plantas à limitação de água, tais como RD29, DREBA e NAC, por exemplo. Já no caso de um gene que codifica para uma dehidrina, os resultados obtidos neste trabalho, permitiram confirmar as expressões diferenciais previamente observadas em C. canephora, também em C. arabica. Contudo, este estudo revelou a importância de outros fatores no controle da expressão desses genes, tais como os ritmos circadianos (ciclos noite/dia), a idade e o “histórico” das plantas, sendo que estas obervações, tornam ainda mais complexa, a interpretação dos dados de expressão diferencial, quando se utiliza material vegetal cultivado em condições de campo.
Identificação e caracterização de genes candidatos para a tolerância à seca em cafeeiro
(Universidade Federal de Lavras, 2009-02-26) Vinecky, Felipe; Andrade, Alan Carvalho
A cultura cafeeira é importante economicamente e amplamente explorada no Brasil. A área plantada está bem difundida em todo território, onde são produzidos C. arabica e C. canephora, dependendo da região plantada. De modo geral, seca e temperaturas desfavoráveis são as principais limitações climáticas à produção do cafeeiro. A importância de tais limitações deve aumentar, em função das mudanças reconhecidas no clima global e, também, porque a cafeicultura vem sendo expandida para regiões marginais onde secas e temperaturas desfavoráveis se constituem em grandes limitações à produção do café. Por isso a pesquisa científica com foco em minimizar os danos causados pelos estresses abióticos é de fundamental importância para a cafeicultura. O objetivo deste trabalho foi identificar genes candidatos para a tolerância à seca, utilizando diferentes estratégias. Inicialmente foi avaliada a expressão diferencial de genes de bibliotecas de folhas de café cultivado em condições de estresse hídrico, por meio de análises in silico dos dados do Genoma Café. Em seguida, foram realizados experimentos com hibridização de macroarranjos de cDNA de café a partir de RNA obtido de folhas de duas cultivares de café, uma tolerante ao estresse hídrico (Clone 14) e outra sensível (Clone 22), ambas submetidas a irrigação normal (controle) e a restrição no fornecimento de água. Por último, a expressão diferencial de 29 genes pré-selecionados nos experimentos de macroarranjo foi analisada, utillizando-se a técnica de PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Para as reações de qPCR as amostras utilizadas foram o Clone 22 irrigado e não irrigado e outros três clones tolerantes (Clone 14, 73 e 120 irrigados e não irrigados). Os resultados obtidos com as análises de qPCR, mostraram que a maioria dos genes testados apresentaram expressão diferencial entre os tratamentos controle e não irrigado, confirmando os dados obtidos nos experimentos de macroarranjos..Todas as técnicas utilizadas neste trabalho, foram eficientes em identificar genes candidatos para a tolerância à seca em cafeeiro, sendo que alguns genes apresentaram resultado positivo de expressão diferencial em todas as três metodologias utilizadas. Os vários genes candidatos responsivos à seca em cafeeiro, identificados neste trabalho, permitem uma melhor compreênsão das estratégias utilizadas pela planta para suportar o déficit hídrico e esses genes, podem também ser usados, para o melhoramento biotecnológico do cafeeiro. Além disto, marcadores moleculares associados à tolerância à seca em cafeeiro podem ser desenvolvidos com base nos genes candidatos identificados, visando-se um programa de melhoramento genético do cafeeiro, por seleção assistida.
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE GENES CANDIDATOS PARA A TOLERÂNCIA À SECA EM CLONES DE CAFÉ CONILON (Coffea canephora)
(2009) Vinecky, Felipe; Alves, Gabriel Sérgio Costa; Freire, Luciana Pereira; Vieira, Natalia Gomes; Marraccini, Pierre; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
O cenário da cafeicultura mundial, mostra o quanto esta cultura é importante economicamente, para diversos países. Para o Brasil, que é o maior produtor e exportador de café, esta commoditie é geralmente, uma das principais fontes de renda para pequenos produtores. A seca, que vem se tornando cada vez mais intensa ao longo dos anos, prejudica a produção desses agricultores, pois reduz a produtividade, podendo causar até a perda da lavoura. Atualmente, a elucidação dos fatores genéticos que conferem tolerância à seca em espécies vegetais é uma prioridade de vários grupos de pesquisa. As respostas ao déficit hídrico certamente envolvem mudanças na expressão gênica e o primeiro objetivo do presente trabalho foi caracterizar essas alterações por meio da caracterização do perfil da expressão gênica em folhas de um clone de C. canephora sensível (clone 22) e um clone tolerante (clone 14), cultivados em condições controle e de estresse hídrico. A técnica que foi utilizada neste trabalho foi a hibridização com macroarranjos de DNA, a qual se mostrou eficiente para se identificar genes diferencialmente expressos entre os tratamentos utilizados (irrigado e não irrigado), assim como diferenciais entre os materiais genéticos estudados (clone tolerante x sensível). Esses genes diferencialmente expressos são potenciais candidatos para a tolerância à seca em cafeeiro e podem ser objeto de estudos experimentais posteriores. Os genes selecionados nos experimentos de macroarranjos, foram também caracterizados utilizando-se a técnica de PCR quantitativo em tempo real (qPCR).. Em sua maioria, os resultados obtidos com as análises de qPCR corroboraram com a expressão diferencial previamente observada nos experimentos com macroarranjos.
Identificação e caracterização de peptídeos opioides presentes na fração proteica dos grãos de Coffea arabica
(Universidade de Brasília, 2015-03-27) Vinecky, Felipe; Bloch Júnior, Carlos
No que diz respeito à cafeicultura e ao processamento dos grãos de café, o conceito de qualidade do produto foi definido sob diferentes aspectos, como, por exemplo, qualidade de produção, níveis de torra, aroma. Acredita-se que muitos dos constituintes do grão influenciam diretamente nas características organolépticas apresentadas pela bebida. Entretanto, pouco se conhece a respeito de quais moléculas estariam desempenhando tais funções, principalmente, em relação a proteínas e peptídeos encontrados no endosperma da semente do café, uma vez que a maioria dos estudos relacionados focam moléculas não protéicas. Alguns peptídeos que são biologicamente ativos, ou seja, bioativos, estão encriptados em proteínas de origem animal e vegetal e podem ser encontrados com a realização de um screening de um banco de dados utilizando parâmetros pré-definidos. Uma das formas de obtenção de peptídeos bioativos é por meio da ingestão de alimentos que contenham proteínas precursoras e que sofram proteólise por enzimas digestivas. No presente trabalho, foi realizada uma avaliação da composição química de Coffea arabica que visou identificar os precursores de qualidade da bebida do café que estivessem associados a proteínas com possíveis sequências de peptídeos opioides como parte de suas estruturas primárias. Para isso foram realizadas análises in silico em bancos de dados internacionais e na base de dados do Genoma Café, buscando peptídeos que apresentassem a região N-terminal (YGG) similar a outros peptídeos opioides. Outra metodologia utilizada foi a digestão do extrato proteico de Coffea arabica var. Acauã com enzimas digestivas, seguido de fracionamento por HPLC e sequenciamento por Espectrometria de Massa. Os peptídeos encontrados estavam encriptados em uma família de proteínas chamada dehidrina. Esses peptídeos, identificados em ambos métodos, foram sintetizados utilizando-se a estratégia Fmoc/t-butila (9-fluorenilmetoxicarbonila) de síntese manual em suporte sólido e tiveram a atividade (opioide) avaliada em modelos in vivo que permitiram determinar suas funções. Os testes utilizados para avaliar a atividade opioide foram o da placa quente e o da retirada da cauda. Foi possível concluir que as metodologias utilizadas para desvendar os peptídeos encriptados mostrou-se ser eficiente, já que todos os peptídeos testados apresentaram atividade antinociceptiva em camundongos.
Imagens por espectrometria de massa (IMS) como uma ferramenta inovadora para estudos moleculares de frutos de café
(2007) Silva, Luciano P. da; Vinecky, Felipe; Barbosa, Éder A.; Andrade, Alan Carvalho; Bloch, Carlos; Embrapa - Café
O desenvolvimento do fruto de café é um processo que pode durar de algumas poucas semanas a mais do que um ano dependendo da espécie e se inicia com a antese até a completa maturação dos frutos. A espécie Coffea arabica requer de 6-8 meses para atingir a maturação. Devido a diversas florações poderem ocorrer em C. arabica em uma mesma estação produtiva, o crescimento dos frutos é assíncrono, com uma mesma planta podendo apresentar proporções variadas de frutos em diferentes estágios de desenvolvimento, o que pode prejudicar a qualidade final da bebida. Com exceção do grande número de estudos relacionados com o metabolismo da cafeína, muito pouco se sabe acerca de proteínas e vias metabólicas importantes para a qualidade da bebida de café. Dessa forma, estudos de expressão de proteínas associados com o perfil de distribuição das proteínas nos tecidos podem fornecer informações importantes para o melhor entendimento do envolvimento de macromoléculas durante o desenvolvimento do fruto de café. A obtenção de imagens moleculares a partir de íons detectados por meio de métodos de espectrometria de massa tem aberto uma nova fronteira no que diz respeito à detecção de moléculas em amostras de tecido. Esta metodologia denominada imaging mass spectrometry tem sido utilizada com sucesso para o mapeamento espacial de peptídeos e proteínas diretamente de amostras de diversos tecidos. No presente estudo, a distribuição espacial de macromoléculas durante diferentes estágios de desenvolvimento de frutos de café é apresentada. Adicionalmente, com a utilização de técnicas de cromatografia foi possível identificar uma proteína diferencialmente expressa e com prováveis modificações pós-traducionais em certas regiões do endosperma.
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DO PROMOTOR FRUTO-ESPECÍFICO DO GENE CALTP1 DE COFFEA ARABICA
(2011) Cotta, Michelle Guitton; Barros, Leila Maria Gomes; Almeida, Juliana Dantas; Santos, Daiene Bittencourt Mendes; Abreu, Mariana Soares; Barbosa, Éder Alves; Vinecky, Felipe; Andrade, Alan Carvalho; Marraccini, Pierre; Embrapa - Café
A disponibilidade de promotores endógenos, não patenteados, que regulem a expressão do transgenes de forma limitada espacial e temporalmente é uma valiosa ferramenta para programas de melhoramento. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar o promotor fruto específico do gene CALTP1 (que codifica uma proteína de transferência de lipídeos - LTP) de Coffea arabica. Por meio de análises in silico baseadas nas seqüências do banco de dados do genoma café, foram encontrados 40 Unigenes preferencialmente expressos em fruto que poderiam ser utilizados como sonda na prospecção de seus respectivos promotores. Usando como critérios o nível de expressão e o ineditismo, o gene CALTP1 foi escolhido para a validação experimental por meio das técnicas de Northern blot e RT- qPCR. Os resultados demonstram que esse gene tem expressão preferencial no endosperma dos frutos aos 120 e 180 dias após o florescimento (DAF). O isolamento do promotor desse gene foi feito por meio da estratégia 5’ RACE. Um fragmento de 1.2 kb foi isolado do DNA genômico de C. arabica var. Catuaí amarelo e três fragmentos menores (1.0, 0.78 e 0.4 kb) oriundos de supressões 5’ do fragmento genômico foram produzidos. Esses fragmentos foram clonados em vetores binários e transformados na planta modelo Nicotiana tabacum para análises de expressão envolvendo o gene repórter uidA codificando para a β-glucuronidase (GUS). Os resultados das análises histoquímicas de atividade GUS mostram que os fragmentos de 1.2, 1.0 e 0.78 kb direcionam a expressão para todos os órgãos testados da planta com diferenças no nível de atividade e, todos os três fragmentos promovem expressão baixa ou nula em raízes. Por outro lado, o fragmento menor de 0.4 kb levou a expressão do gene uidA somente nas sementes, tecidos florais e frutos.
Prospecção de promotores tecido-específicos em café
(Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2008-12) Almeida, Juliana D.; Barros, Leila M.G.; Santos, Daiene B. M.; Cotta, Michelle G.; Barbosa, Eder. A.; Cação, Sandra B.; Eira, Miriam T. S.; Alves, Gabriel S.C.; Vinecky, Felipe; Pereira, L.F.P.; Silva, Felipe R.; Andrade, A. C.; Marraccini, Pierre; Carneiro, M.
A maioria dos organismos transgênicos relatados na literatura foi obtida utilizando promotores constitutivos. No entanto, existem restrições econômicas, ambientais e de biossegurança relacionadas à expressão indiscriminada (constitutiva) de genes heterólogos. O uso de promotores tecido-específicos e induzidos podem suavizar esses problemas por limitar a expressão do transgene aos tecidos e às condições necessárias. Os promotores atualmente utilizados pela EMBRAPA são de propriedade transnacional, onerando as pesquisas e causando dependência tecnológica. Portanto, o objetivo deste trabalho foi o de encontrar e caracterizar promotores específicos de tecidos e órgãos em Coffea spp. Nós utilizamos o banco de dados genoma Café como ferramenta in silico para identificar genes expressos preferencialmente em raiz, folha e fruto. Dessa forma, achamos 72 candidatos órgão-específicos: 18 expressos em folhas, 14 em raiz e 40 em frutos. Alguns desses candidatos foram testados in vitro utilizando-se ensaios RT- PCR, PCR semi-quantitativa, northern blotting e qPCR. Todos os quatro candidatos folha-específicos testados (GCFo1, GCFo2, GCFo3 e GCFo4) e pelo menos um dos dois candidatos fruto- específicos testados (GCFr1 e GCFr2) tiveram o seu caráter órgão-específico confirmado. Ensaios de expressão temporal e espacial mostraram que GCFr2 tem um pico de expressão no endosperma, 180 dias depois do florescimento. Os genes mais expressos de folha (GCFo3 e GCFo4) e de fruto (GCFr2) foram usados como sondas para isolar seus respectivos promotores através do screening de bibliotecas de BAC ou utilizando a técnica de 5 ́RACE.