SPCB - Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil
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Resultados da Pesquisa
Item Produção de plantas transgênicas de café resistentes ao herbicida glufosinato de amônio(2005) Ribas, Alessandra Ferreira; Kobayashi, Adilson Kenji; Pereira, Luiz Felipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Embrapa - CaféPlantas transgênicas de Coffea canephora P. resistentes ao herbicida glufosinato de amônio foram regeneradas a partir de explantes foliares co-cultivados com Agrobacterium tumefaciens EHA105 contendo o plasmídio pCAMBIA3301, que contém os genes bar e uidA ambos sob controle do promotor 35S ou pIBI3 (3300 contendo o gene da ACC oxidase, antisenso) ou ainda bombardeados com o plasmídio pCAMBIA3301. Embriogênese somática direta foi induzida no meio contendo ¼ dos macros e metade dos micronutrientes do meio MS, constituintes orgânicos do meio B5 e 30 g.L-1 de sacarose, suplementado com 5mM N6 - (2-isopentenil)adenina (2-iP) e 10 mM de glufosinato de amônio para seleção de embriões transgênicos putativos. A presença e a integração do gene bar foram confirmados pelas análises de PCR e Southern blot. As plantas transgênicas pulverizadas com 1600 mg.L-1 do herbicida Finale que contém glufosinato como ingrediente ativo, não apresentaram sintomas de toxidez, mantiveram a coloração e continuaram crescendo normalmente na aclimatação ex vitro.Item Transformação genética de Coffea canephora mediada por Agrobacterium tumefaciens com gene heterólogo de ACC-oxidase na orientação anti-senso(2003) Ribas, Alessandra Ferreira; Kobayashi, Adilson Kenji; Cação, Sandra Maria Bellodi; Pereira, Luiz Felipe Protasio; Ayub, Ricardo Antônio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféO fitorregulador etileno está associado a vários eventos fisiológicos em plantas. Em frutos climatéricos, um aumento dramático na síntese de etileno promove os passos subseqüentes do amadurecimento. Uma das alternativas para obtenção de plantas com maturação uniforme é o controle da síntese do fitorregulador etileno, pode ser feito através da transformação genética de plantas com genes da sua rota metabólica em orientação anti-senso. A enzima ACC oxidase, que catabolisa o último passo da biossíntese deste fitoregulador, tem sido um dos alvos preferidos para inibição com genes anti-senso, com uma conseqüente redução na produção de etileno. O objetivo deste trabalho foi introduzir o gene da ACC-oxidase do melão em plantas de C. canephora P. via Agrobacterium tumefaciens, usando o herbicida glufosinato de amônio como agente seletivo. Explantes de C. canephora foram cultivados em meio para indução de embriogênese direta ED (1/4 macro e 1/ 2 dos micronutrientes do meio MS, vitaminas do meio B 5 , 30 g.L -1 de sacarose, 100 mg.L -1 de cisteína), suplementados com 5 mM de 2-iP por três semanas. Os explantes foram imersos em suspensão de Agrobacterium tumefaciens EHA105 contendo o plasmídio pIBI3 que contém os genes da fosfinotricina acetiltransferase (bar) e da ACC-oxidase do melão na orientação anti-senso. Os explantes foram submetidos à sonicação por 2 segundos, sendo em seguida transferidos para meio ED e co-cultivados por 4 dias a 24° C no escuro. Após este período, os explantes foram transferidos para meio ED fresco contendo 10 mM de glufosinato e 400 mg.L -1 de cefotaxima. Inicialmente, 87 explantes foram co-cultivados e produziram 18 calos embriogênicos resistentes ao glufosinato quatro meses após a infecção. Embriões transgênicos putativos foram transferidos para meio ED sem fitoreguladores para permitir germinação. As plântulas provenientes de cinco eventos independentes foram aclimatadas em casa-de-vegetação. A análise de PCR confirmou a presença de fragmentos amplificados do gene bar (516 pb) em 44 das 62 plantas analisadas. Em plantas controle (não transformadas) nenhuma amplificação foi observada. A análise de Southern blot foi conduzida para avaliar a integração do gene da ACC oxidase de melão em plantas de C. canephora P. Os resultados demonstraram a presença do transgene em todas as seis plantas analisadas. A dupla digestão com as enzimas de restrição EcoR I e Hind III, liberou um fragmento de aproximadamente 1200 pb que hibridizou com a sonda correspondente ao transgene. Plantas transformadas e plantas controle foram pulverizadas com 1% (v/v) de uma formulação comercial de herbicida (Finale, AgrEvo â ) contendo 20% de glufosinato de amônio. Plantas controle demonstraram os primeiros sintomas de intoxicação 48 h após a pulverização devido a acumulação de amônia nos tecidos, e uma semana após as plantas estavam totalmente necrosadas. Nas plantas transformadas nenhum sintoma foi observado. As plantas estão em fase de crescimento em casa-de-vegetação. A determinação da produção de etileno será realizada, através de cromatografia gasosa, quando as plantas iniciarem a frutificação.Item Transformação de Coffea canephora P. com gene para resistência à herbicida através de bombardeamento de partículas(2001) Ribas, Alessandra Ferreira; Kobayashi, Adilson Kenji; Bespalhok, João Carlos; Galvão, Rafaelo Marques; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféO objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo de transformação de Coffea canephora P. através de bombardeamento de partículas, usando o herbicida glufosinato de amônio como agente seletivo. Explantes foliares de C. canephora foram usados para indução de embriogênese somática. Inicialmente, explantes foram cultivados em meio ED suplementado com 5 mM de 2iP por 40 dias. Explantes com embriões somáticos foram então transferidos para meio contendo a metade da concentração dos macro e micronutrientes dos sais de MS suplementado com 9 mM de 2,4 D. Após duas semanas, explantes com embriões somáticos e tecido embriogênico foram bombardeados com partículas de tungstênio (M-25) cobertas com o plasmídio pCambia 3301 (contendo os genes bar e gus), usando um sistema de aceleração de partículas com alta pressão de hélio (PDS 1000/He - BioRad). As condições usadas para o bombardeamento foram: 1.300 psi de pressão; 60 ou 90 mm de distância percorrida pelas partículas; e pré e pós-cultivo dos explantes em meio com alta osmolaridade. Os explantes bombardeados foram submetidos a seleção em meio ED contendo 5 mM de glufosinato de amônio. Após seis meses, embriões transgênicos putativos foram transferidos para meio ED sem reguladores de crescimento para germinação. A análise histoquímica do gene gus nessas plântulas foi positiva, enquanto nenhuma atividade foi observada em plantas controle. A integração do gene bar foi confirmada pela análise de PCR.Item Transformação de café mediada por Agrobacterium tumefaciens(2001) Ribas, Alessandra Ferreira; Kobayashi, Adilson Kenji; Bespalhok, João Carlos; Galvão, Rafaelo Marques; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféO objetivo deste trabalho foi estabelecer protocolos de transformação genética mediada por Agrobacterium tumefaciens para as espécies C. canephora e C. arabica, usando o herbicida glufosinato de amônio como agente seletivo. Explantes de C. canephora foram cultivados em meio para indução de embriogênese direta, suplementados com 5 mM de 2-iP por três semanas. Para C. arabica, tecidos embriogênicos foram induzidos em meio WPM suplementado com 1,7 mM de BA e 0,7 mM de GA3. Os explantes e os tecidos embriogênicos foram imersos em suspensão de Agrobacterium tumefaciens EHA105 contendo o plasmídeo pCambia3301, que contém genes de b-glucuronidase (gus) e fosfinotricina acetiltransferase (bar), que confere resistência ao glufosinato de amônio, ou pIBI3, que contém o genes bar e ACC-oxidase de melão na orientação anti-senso. Os explantes foram submetidos à sonicação por 2 segundos e transferidos para meio ED no escuro e co-cultivados por quatro dias a 24oC. Após esse período, foram transferidos para meio ED fresco contendo 10 mM de glufosinato e 400 mg.L -1 de cefotaxima. Tecidos embriogênicos de C. canephora e C. arabica resistentes ao glufosinato de amônio foram submetidos à análise histoquímica do gene gus. A atividade do gene gus foi detectada em 82,2% dos tecidos de C. canephora testados e nos calos recém-formados de C. arabica resistentes ao glufosinato de amônio. A integração do gene bar foi confirmada em tecidos embriogênicos de C. canephora pela análise de PCR.Item Identificação e caracterização de genes de ACC oxidase de café(2001) Galvão, Rafaelo Marques; Kobayashi, Adilson Kenji; Ribas, Alessandra Ferreira; Bespalhok, João Carlos; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféO fitorregulador etileno está associado a vários eventos fisiológicos em plantas. Em frutos climatéricos, um aumento dramático na síntese de etileno promove os passos subseqüentes do amadurecimento. A enzima ACC oxidase catalisa o último passo de biossíntese deste fitorregulador, convertendo 1-aminociclopropano-1- ácido carboxílico (ACC) em etileno. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar genes de ACC oxidase de Coffea spp. para serem usados subseqüentemente em projetos de transformação genética visando o controle da maturação dos frutos. Oligonucleotídeos baseados em regiões conservadas de genes heterólogos de ACC oxidase foram projetados para amplificar o fragmento a partir de cDNA. Fragmentos de cDNA amplificados foram clonados no vetor pUC 18 através do SureClone TM Ligation Kit (Amershan Pharmacia Biotech). Um clone completo de 0,96 Kb de C. arabica foi obtido. A sequência de nucleotídeos e de aminoácidos demonstrou alta homologia com ACC oxidase de Actinidia , Carica, Prunus e Betula. Para determinar o padrão de expressão do gene em diferentes tecidos e de frutos em diferentes estádios de maturação foi usada a técnica de RT-PCR. Houve diferentes níveis de expressão de ACC oxidase nos tecidos testados. Como esperado, a expressão de ACC oxidase foi elevada em frutos de café em fases iniciais de amadurecimento. O gene de ACC oxidase foi clonado em orientação anti-senso em vetores para transformação direta e em vetores binários, contendo promotor e terminador 35S CaMV.Item Thidiazuron como indutor de embriogênese somática em café (Coffea canephora Pierre)(2000) Kobayashi, Adilson Kenji; Pereira, Luiz Felipe Protasio; Bespalhok, Carlos; Ribas, Alessandra Ferreira; Galvão, Rafaelo Marques; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféOs efeitos de thidiazuron (TDZ) na indução de embriogênese somática em Coffea canephora foi investigado. Explantes foliares de C. canephora foram cultivados em um meio de cultura suplementado com diferentes concentrações de TDZ. Embriões somáticos foram observados nas concentrações de 0,25 até 2 mM, após dois meses em cultivo. Dentre os tratamentos testados, TDZ a 1 mM mostrou a mais alta freqüência de explantes com regeneração e maior número de embriões por explante. Entretanto, a indução de embriogênese somática ocorreu de forma não-sincronizada com todos os tratamentos investigados apresentando embriões em diferentes estádios de desenvolvimento.Item Micropropagação do cafeeiro(2002) Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Kobayashi, Adilson Kenji; Embrapa - CaféIntrodução ...... 147 Métodos tradicionais de propagação ...... 148 Métodos de propagação in vitro ...... 150 Microestacas ...... 151 Embriogênese somática ...... 153 Embriogênese direta ...... 154 Embriogênese indireta ...... 156 Multiplicação em larga escala ...... 159 Prioridades de pesquisa e aplicações ...... 161 Referências bibliográficas ...... 162 INTRODUÇÃO O gênero Coffea L. possui cerca de 100 espécies (Cramer, 1957), sendo que somente duas espécies de café apresentam importância comercial e são plantadas de maneira extensiva, Coffea arabica L. (arábica) e Coffea canephora P. ex Fr. (robusta). Coffea arabica é nativa do nordeste da África, em uma área que compreende o sudoeste da Etiópia, sudeste do Sudão e norte do Quênia, sendo atualmente cultivado em regiões tropicais com altitudes acima de 500 metros, representando 70% mercado mundial de café. Esta espécie é a única tetraplóide (2n = 44) e autógama do gênero. A ausência de efeitos deletérios causados por autofecundações sucessivas e a baixa porcentagem de fecundação natural (Carvalho e Mônaco, 1962), fazem com que a forma predominante de propagação do café arábica seja feita por sementes. Coffea canephora, como as outras espécies conhecidas do gênero Coffea, é diplóide (2n=22), apresentando auto-incompatibilidade do tipo gametofítica. Normalmente é plantado na África e na Ásia, em regiões de baixa altitude (geralmente abaixo de 850 m) e clima quente. No Brasil, o café robusta é produzido principalmente nos estados do Espírito Santo e Rondônia. Considerado como produtor de bebida caracterizada como neutra, é utilizado na manufatura de café solúvel e na elaboração de misturas. Como esta espécie é autoincompatível, cada semente resulta em uma planta híbrida. Se por um lado esta característica possibilita uma ampla base genética para a seleção de indivíduos superiores, constituí-se em um problema para a produção de genótipos superiores em larga escala. No melhoramento do cafeeiro, ganhos genéticos para produtividade e outras características de interesse agronômico são incorporadas através de cruzamentos. Entretanto, durante o processo de obtenção de cultivares de cafeeiro utilizando as metodologias de melhoramento convencional, um ciclo de seleção pode levar até quatro anos, considerando da obtenção de sementes até o florescimento das plantas e, novamente, a obtenção de sementes. Além disso, para obter dados consistentes, a avaliação de características relacionadas à produtividade é normalmente realizada em plantas com 6-8 anos de idade. Assim, se considerarmos que, a partir do cruzamento inicial, vários ciclos de seleção são necessários para encontrar genótipos de cafeeiro com características desejáveis do ponto de vista agronômico, um programa convencional de melhoramento pode demorar até 30 anos para obter novos cultivares. Dessa forma, o desenvolvimento de técnicas para propagação acelerada de plantas de cafeeiro é fundamental para aumentar a taxa de multiplicação e possibilitar a rápida difusão de novos cultivares.